Этот протокол облегчает изоляцию функционально различных фибробластов от кожи человека путем сортировки FAC на основе выражения маркера поверхности клетки. Впервые папиллярные и ретикулярные фибробласты могут быть изолированы непосредственно от кожи без манипуляций с пробирки. Это огромный прогресс по сравнению с ранее установленными методами изоляции с использованием культур explant.
Дермальные подмножества фибробластов питают различные функции в гомеостатической обстановке. С помощью этого инструмента можно исследовать функциональные различия в патологиях кожи, включая рак или воспалительные заболевания кожи. Поскольку обработка человеческой ткани требует некоторой практики для достижения удовлетворительных урожаев клеток, мы хотели бы обеспечить визуальную демонстрацию для облегчения и ускорения этого процесса.
Чтобы подготовить полную толщину дермы, поместите кусок человеческой кожи на толстую фильтровальную бумагу с эпидермисом лицом вниз. Держите эпидермис плотно с типсами, и соскребать подкожный слой жира скальпелем. Затем нарежьте ткань полосками шириной в пять миллиметров, прежде чем положить их в чашку Петри.
Чтобы раздел дермы на папиллярные и ретикулярные слои, поместите кусок кожи на толстую фильтровальную бумагу с эпидермисом, обращенным вверх. Держите кожу плотно по краям с типсами, и нарезать раздел толщиной 300 микрометров с электрическим дерматомом. Перенесите первый слой, состоящий из эпидермиса и папиллярной дермы, в чашку Петри.
Затем немедленно перейти к отделить эпидермис и дермы, или добавить 1x PBS держать ткани от высыхания. Затем отрегулируйте дерматом до толщины резки 700 микрометров и нарежьте оставшуюся дерму. Поместите верхний кусочек, который определяется как верхний ретикулярный дермы, в отдельную чашку Петри.
Впоследствии, соскребать подкожный слой жира скальпелем из остаточного нижнего ретикулярного дермального слоя, и отбросить его. Соберите нижнюю ретикулярную дерму в другом блюде Петри. Немедленно приступайте к процедуре энзиматической пищеварения или добавьте 1x PBS, чтобы ткань не высохла.
Для выполнения ферментативного пищеварения поместите пятимиллиметровые полоски кожи или эпидермис/папиллярную дерму с эпидермисом, обращенным вверх, в чашку Петри с 10 миллилитров диссоциирующего ферментного раствора. Затем инкубировать чашку Петри при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. После инкубации перенесите эпидермис/папиллярную дерму на крышку чашки Петри.
Отделить эпидермис от верхней дермы с двумя типсами, каждый из которых держит край дермы. Впоследствии, фарш каждого дермального слоя как можно тщательнее. Чем меньше кусочки, тем лучше пищеварение тканей.
Затем приготовьте смесь пищеварения. Перенесите рубленую ткань с 10 миллиметрами подготовленной смеси пищеварения в 50-миллиметровую трубку. Инкубировать ткани при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа под возбуждение.
Переверните трубку несколько раз во время пищеварения. Чтобы подготовить одноклеточную суспензию, прекратите переваривание энзиматической ткани, добавив 10 миллилитров фибробластовой среды в переваренную ткань на льду. Затем налейте содержимое каждой трубки через обычный стерильный нержавеющий чай ситечко, и собирать подвеску клетки в чистой чашке Петри.
Вымойте ситечко со средним, и пюре непереваренных частей ткани с краем шприца поршень. После этого пипетка собрала подвеску клетки через 70-микрометровый клеточный ситечко в 50-миллилитровую трубку. Промыть ситечко клетки со средним, и собирать поток через ту же трубку.
Затем центрифуга трубки при 500 раз г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Удалите супернатант и вымойте клеточные гранулы пятью миллилитров фибробластовой среды. Повторите шаг центрифугации еще раз.
После этого удалите супернатант и повторно снимите гранулы в один миллилитр буфера эритроцитов ACK. Оставьте клетки в буфере лиза примерно на одну минуту при температуре окружающей среды. Затем, остановитьлиз, добавив девять миллилитров 1x PBS с 10%FCS.
Центрифуга трубки снова в 500 раз г при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, и отказаться от супернатанта впоследствии. После того, как клетки были окрашены для сортировки FAC следующие стандартные протоколы, сортировать три фибробластов субпопуляции в отдельные микроцентрифуг трубки заполнены либо с 350 микролитров лиза буфера для изоляции РНК или 350 микролитров фибробластовой среды роста для клеточной культуры. Инвертировать трубы немедленно, и либо положить лиза буферных труб в жидкий азот, или положить фибробласта роста средних труб на льду.
После FACS, спина клетки вниз на 500 раз g в течение трех минут при четырех градусах по Цельсию. Затем, пластины равное количество клеток в фибробластовой среды роста в 24-хорошо клеточной культуры блюдо, и оставить их расти, пока они не достигнут 70% слияния. Затем замените культурную клеточную среду средой дифференциации адипоцитов и дайте клеткам продифференцироваться в течение 14 дней.
При дифференциации день 14, исправить клетки с 4%PFA в течение 20 минут. Вымойте скважины 60%изопропанолом, и дайте ему полностью испариться. Затем, пятно клеток с пятью миллимоларами фильтрованного масла Red O в течение 20 минут.
Через 20 минут промойте окрашенные клетки четыре раза дистиллированной водой. Изображение клеток, погруженных в воду с перевернутым микроскопом при 10-м увеличении с передаваемым светом. Этот протокол позволяет идентифицировать три популяции фибробластов в коже человека, что представляет собой различную интрадерматальную локализацию, профили экспрессии генов и функции.
FAP-положительный CD90-отрицательный обогащены в сосочковой дерме, в то время как FAP-положительный CD90-положительный и FAP-отрицательный CD90-положительный более обильны в ретикулярной дерме. Все три отсортированы субпопуляции отображения типичных фибробластов морфологии на культуру в течение семи дней. Интересно, что они ведут себя по-разному в анализе адипогенза.
После 14 дней в культуре, FAP-положительный CD90-отрицательный не дифференцируются в адипоциты, в то время как FAP-положительный CD90-положительный и FAP-отрицательный CD90-положительный легко проходят адипогенез. Профилирование экспрессии генов показывает, что FAP-положительные CD90-отрицательные клетки выражают высокий уровень маркеров, обычно приписываемых папиллярным фибробластам, таким как CD26, NTN и PDPN, в то время как CD90-положительные клетки выражают известные ретикулярные маркеры, такие как CD36, гладкий актин мышц и PPAR-гамма на высоких уровнях. Мы приходим к выводу, что FAP-положительные CD90-отрицательные клетки принадлежат к сосочковой и CD90-положительной клетки принадлежат к ретикулярной линии.
Пищеварение работает лучше всего, если кожные кусочки тщательно фарш и инкубируется в достаточном количестве пищеварения среды. Дермальные фибробластые подмножества функционально разнообразны. Изучение их функции в контексте патогенеза болезни проложит путь для новых диагностических и терапевтических вмешательств.
