Bu protokol, hücre yüzeyi belirteç ifadesine göre FAC sıralama sı ile insan derisinden işlevsel olarak farklı fibroblast alt kümelerinin izolasyonuna olanak sağlar. İlk kez, papiller ve retiküler fibroblastlar in vitro manipülasyon olmadan doğrudan deriden izole edilebilir. Bu ekstrbitki kültürleri kullanarak daha önce kurulmuş izolasyon yöntemleri ile karşılaştırıldığında büyük bir ilerlemedir.
Dermal fibroblast alt kümeleri homeostatik koşullarda farklı fonksiyonlar barındırmaktadır. Bu alet ile kanser veya inflamatuar cilt hastalıkları da dahil olmak üzere cilt patolojilerinde fonksiyonel farklılıkları araştırmak mümkündür. İnsan dokusunun işlenmesi tatmin edici hücre verimleri elde etmek için bazı uygulama gerektirdiğinden, bu süreci kolaylaştırmak ve hızlandırmak için görsel bir gösteri sağlamak istiyoruz.
Tam kalınlıkta dermis hazırlamak için, epidermis aşağı bakacak kalın bir filtre kağıdı üzerinde insan derisinin bir parça yerleştirin. Epidermisi forceps ile sıkıca tutun ve deri altı yağ tabakasını neşterle kazıyın. Daha sonra, bir Petri kabına koymadan önce beş milimetre genişliğinde şeritler halinde doku dilimleyin.
Dermisi papiller ve retiküler tabakalara dönüştürmek için, epidermisin yukarı bakacak şekilde kalın bir filtre kağıdına bir deri parçası yerleştirin. Cildi pİşplerle kenarlarında sıkıca tutun ve elektrikli bir dermatomile 300 mikrometre kalınlığında bir bölümü dilimleyin. Epidermis ve papiller dermisten oluşan ilk tabakayı Petri kabına aktarın.
Daha sonra, epidermis ve dermis ayırmak için hemen devam, ya da kurumasını doku tutmak için 1x PBS ekleyin. Daha sonra, 700 mikrometre bir kesme kalınlığı için dermatom ayarlayın ve kalan dermis dilim. Üst retiküler dermis olarak tanımlanan üst dilimi ayrı bir Petri kabına yerleştirin.
Daha sonra, artık alt retiküler dermal tabakadan bir neşter ile deri altı yağ tabakası kazıyın ve atın. Başka bir Petri kabında alt retiküler dermis toplamak. Hemen enzimatik sindirim prosedürüne devam edin veya dokunun kurumasını engellemek için 1x PBS ekleyin.
Enzimomatik sindirim gerçekleştirmek için, beş milimetrelik deri şeritleri veya epidermis / papiller dermis epidermis bir Petri çanak yukarı bakan bir petri çanak ile 10 mililitre ayırıcı enzim çözeltisi yerleştirin. Sonra, Petri kabını 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra epidermis/papiller dermisi Petri kabının kapağına aktarın.
Epidermisin üst dermisini her biri dermisin kenarını tutan iki forceps ile ayırın. Daha sonra, mümkün olduğunca iyice her dermal tabaka kıyma. Parçalar ne kadar küçükse doku sindirimi o kadar iyi.
Sonra, sindirim karışımı hazırlayın. Hazırlanan sindirim karışımı10 milimetre ile kıyma doku aktarın 50 milimetrelik bir tüp içine. Dokuyu 37 derecede bir saat boyunca ajitasyon altında kuluçkaya yatırın.
Sindirim sırasında tüpü birkaç kez ters çevirin. Tek hücreli süspansiyon hazırlamak için, buz üzerinde sindirilmiş dokuya fibroblast orta 10 mililitre ekleyerek enzimatik doku sindirimini durdurun. Sonra, düzenli bir steril paslanmaz çay süzgeci ile her tüpün içeriğini dökün ve temiz bir Petri çanak hücre süspansiyon toplamak.
Orta ile süzgeç yıkayın ve bir şırınga piston kenarı ile sindirilmemiş doku parçaları püre. Daha sonra, pipet 50 mililitrelik bir tüp içine 70 mikrometre hücresüz ile toplanan hücre süspansiyon. Hücre süzgecini orta ile durulayın ve aynı tüpten akışı toplayın.
Daha sonra tüpü 500 kez g'de 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve fibroblast orta beş mililitre ile hücre pelet yıkayın. Santrifüj adımını tekrarlayın.
Daha sonra, supernatant çıkarın ve ACK eritrosit lysis tampon bir mililitre pelet resuspend. Hücreleri ortam sıcaklığında yaklaşık bir dakika lysis tamponunda bırakın. Daha sonra , %10 FCS ile 1x PBS dokuz mililitre ekleyerek lysis durdurun.
Tüpü tekrar 500 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin ve daha sonra süpernatant'ı atın. Hücreler standart protokolleri izleyerek FAC sıralaması için boyandıktan sonra, üç fibroblast alt popülasyonlarını rna izolasyonu için 350 mikrolitre likit tampon veya hücre kültürü için 350 mikrolitre fibroblast büyüme ortamı ile doldurulmuş ayrı mikrosantrifüj tüplere sıralayın. Tüpleri hemen ters çevirin ve ya sıvı nitrojen içine lysis tampon tüpleri koymak, ya da buz fibroblast büyüme orta tüpler koymak.
FACS'ı takiben hücreleri 500 kez g'de üç dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün. Daha sonra, 24 kuyulu hücre kültür çanak fibroblast büyüme orta hücrelerinin eşit miktarda plaka, ve onlar% 70 kesişme ulaşın kadar büyümeye bırakın. Daha sonra, kültürlü hücre ortamını adiposit farklılaştırma ortamıyla değiştirin ve hücrelerin 14 gün boyunca farklılaşmasına izin verin.
Farklılaşma 14 gün, 20 dakika için% 4 PFA ile hücreleri düzeltmek. % 60 isopropanol ile kuyuyıkama ve tamamen buharlaşmasına izin. Sonra, 20 dakika boyunca filtrelenmiş Yağ Red O beş milimolar ile hücreleri leke.
20 dakika sonra, lekeli hücreleri dört kez distile su ile yıkayın. İletilen ışıkla 10 x büyütmede ters bir mikroskopla suya daldırılan hücreleri görüntüleyin. Bu protokol, insan derisinde farklı intradermal lokalizasyon, gen ekspresyonu profilleri ve fonksiyonları ile ortaya çıkan üç fibroblast popülasyonunun tanımlanmasını sağlar.
FAP-pozitif CD90-negatif papiller dermis zenginleştirilmiş, FAP-pozitif CD90-pozitif ve FAP-negatif CD90-pozitif retiküler dermis daha bol ise. Üç sıralanmış alt popülasyon da yedi gün boyunca tipik fibroblast morfolojisi gösterir. İlginçtir, onlar bir adipogenesis tsay farklı davranın.
Kültürde 14 gün sonra FAP-pozitif CD90-negatif adipositlere ayırmazken, FAP-pozitif CD90-pozitif ve FAP-negatif CD90-pozitif adipogenez geçirilmeye devam edilir. Gen ekspresyonu profilleme, FAP-pozitif CD90-negatif hücrelerin genellikle cd26, NTN ve PDPN gibi papiller fibroblastlara atfedilen yüksek düzeyde belirteçler ifade ettiğini gösterirken, CD90-pozitif hücreler CD36, düz kas aktinvesi ve PPAR-gama gibi bilinen retiküler belirteçleri yüksek seviyelerde ifade eder. FAP-pozitif CD90-negatif hücrelerin papiller, CD90-pozitif hücrelerin retiküler sile ait olduğu sonucuna varıyoruz.
Dermal parçalar iyice kıyılmış ve sindirim ortamı yeterli miktarda inkübe ise sindirim en iyi şekilde çalışır. Dermal fibroblast alt kümeleri fonksiyonel olarak çeşitlidir. Hastalık patogenezi bağlamında işlevlerinin araştırılması yeni tanı ve tedavi girişimlerinin önünü açacaktır.
