פרוטוקול זה הוא משמעותי כפי שהוא מתאר שיטה אשר ניתן להשתמש בהם כדי להפריד מספר אותות פלואורסצנטיים בדגימה אחת. בהשוואה לשיטות מסורתיות, סריקת העירור יכולה להגביר את מהירות הניסוי ולשפר את רגישות הנתונים. על ידי שימוש במקורות תאורה שונים כגון לייזר רצף על, שיטה זו עשויה להיות ישימה עבור דיסק מסתובב או לייזר סריקת מערכות מיקרוסקופ קונפוקל.
בעת ביצוע סריקות גירוי, מיקרוסקופ הדמיה ספקטרלית, חשוב לבדוק כי שיא העירור של כל תווית פלואורסצנטי מתרחשת באורך גל שונה. כדי להתחיל, הגדר מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך ומצלמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן טען את הדגימה על הבמה.
מהתפריט הנפתח של החלון הראשי של המיקרו-ניהול, בחר 475 ננומטר לצפייה ראשונית בדגימה. לאחר מכן לחץ פעמיים על התיבה לצד החשיפה והזן 100 כדי להגדיר את זמן החשיפה ב- 100 אלפיות השניה. לבסוף, לחץ על שידור חי כדי להציג את הדוגמה.
עכשיו לחץ על אוטומטי. לחצן טווח הצפייה בעוצמה אוטומטית כדי להביא את הערכים המינימליים והמקסימום לטווחים חזותיים משמעותיים. לאחר מכן, השתמשו ב ידיות המיקוד של המיקרוסקופ כדי למקד את הדגימה.
לאחר ההתמקדות, התאם את מיקום המדגם כך שהקצה שלו יהיה במרכז שדה התצוגה. ואז לכוונן את המיקוד. הדגימה נמצאת במוקד כשתכונות הקצה בתמונה נראות חדות.
עכשיו, פתח את כלי הרכישה הרב-ממדי. בתפריט, לחצו על הלחצן 'טען' ובחרו קביעה מוגדרת מראש הכוללת טווח אורך גל מתאים לרכישה ספקטרלית. לאחר אישור הגדרות הרכישה, עבור לאזור ריק של הדגימה ולחץ על רכישה כדי לאסוף מחסנית תמונה ספקטרלית המכילה רקע ורעש לשימוש לצורך חיסור מאוחר יותר.
לאחר מכן, עבור על הדוגמה כדי למצוא את האזורים הבהירים ביותר. דגימות צפויות להיות פלואורסצנטיות אינטנסיבית יותר הרחק מקצה המדגם. לאחר מיקום האזור הבהיר ביותר, יש לקחת ערימת תמונות בודדת.
טען את התמונה שנרכשה לתוך Image J ולהשתמש בפונקציית המידה של Image J כדי לאשר כי אורכי גל לא מכילים פיקסלים שלא נתגלה יתר על המידה. אם יש צורך בזמן חשיפה מופחת עקב חשיפת יתר, יש לכבוש מחדש את תמונת הרקע עם זמן חשיפה חדש גם כן. אם נמצא כי אחת מהתמונות מכילה את מגבלת הזיהוי כלפי מעלה של המצלמה, התאם את זמן החשיפה של הסריקה הספקטרלית כדי להבטיח שהאות המרבי בטווח הספקטרלי לא יחרוג מהטווח הדינמי של המצלמה.
עם זמן חשיפה מתאים שנקבע כעת, מניחים דגימה ללא תווית על הבמה. רכוש נתוני תמונה ספקטרליים מהדגימה ללא תכלית כדי לקבוע אם קיימת שפעת אוטומטית בסיסית. לאחר מכן, מקם דגימה עם תווית אחת על הבמה.
רכוש נתוני תמונה ספקטרליים מכל אחת מהדוגמאות עם התווית הבודדת כדי להשתמש בהם כפקדים ספקטרליים לבניית ספריה ספקטרלית. בצע את הסריקה עבור כל דגימת בקרה באמצעות זמן חשיפה זהה לטווח אורך הגל והגדרות המצלמה. לאחר מכן, מקם שקופית המכילה את הדגימה הניסיונית במיקרוסקופ.
בחר שדה תצוגה עם תוויות מתאימות לתאים והשיג את נתוני התמונה הספקטרליים מהדגימה באמצעות הגדרות הרכישה שנקבעו. תקן תמונות לתגובה ספקטרלית שטוחה על-ידי חיסור ספקטרום הרקע מתצלמת הדגימה והכפלת התמונה במקדם התיקון. כאן, סקריפט MATLAB משמש לעיבוד מהיר של התמונות.
לאחר מכן, צור את הספרייה הספקטרלית. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לנרמל כל חבר קצה לרצועה באורך הגל בעוצמה הגדולה ביותר על-ידי קביעת הערך האינטנסיבי ביותר של רצועת אורך הגל וחלוקת המדידה בכל רצועת אורך גל בערך מרבי זה. לאחר מכן שמור את הנתונים הספקטרליים כקובץ dat.
לאחר השלמת הפעולה, בטל את ההבעה של נתוני התמונה הספקטרלית. הצעד הבלתי מעורער ייצור תמונת שפע עבור כל תווית פלואורסצנטית, שבה שפע הוא כמות האות הפלואורסצנטי היחסי בתמונה מהתווית הפוטנציאלית. לאחר מכן, פתח כל תמונה ללאmixed כדי לבדוק באופן חזותי את התפלגות הרכיבים הטהורים.
השווה את גודל תמונת השגיאה לאלה של התמונות שאינן מוקסות. אם גודל תמונת השגיאה דומה לתמונות השפע שלא נבעו, ייתכן שאותות נתוני התמונה הספקטרלית לא יצוצו במדויק. לבסוף, ודא כי אין מבנים שיורית לא מזוהה על ידי השוואת תמונת השגיאה לתמונות unmixed.
כאשר מתבצע כראוי, תהליך unmixing ספקטרלי מאפשר הפרדה של ערימת תמונה ספקטרלית לתוך תרומות בהתאמה מכל תווית פלואורסצנטיות. כאן, ערכת תמונה ספקטרלית ללא מעופש עם תמונות בודדות המדגישות את השפע האוטומטי של תאי השריר החלקים בדרכי הנשימה, בדיקה של GCaMP ותווית מיטוכונדרית. קיימת שגיאה גבוהה הקשורה לאזורים הגרעיניים וה perinuclear של התאים המציין כי הספקטרום הנמדד של אזורים אלה אינם אחראים היטב על ידי ספקטרום בספריה ספקטרלית.
ספקטרום טהור שנאסף מתאים מסומנים כי הם גם autofluorescent צפוי לזהם את הפרופיל הספקטרלי עבור הרכיב הטהור. כאן, ניתן לראות את ההבדל של unmixing עם ספקטרום טהור מזוהם עם שפעת אוטומטית, לעומת ספקטרום טהור מתוקן לאחר הפחתה בקנה מידה. רכישת נתונים נכונה היא חיונית כאשר דימות דגימות רגישות כפי שהם עשויים לשרוד רק הפעלת הדמיה אחת בניגוד לרקע ופקדים אשר ניתן לדמיין מחדש.
ודא שהגדרות החומרה והרכישה המתאימות נקבעות מראש ככל האפשר. כשלל הבא, קטעי וידאו שנוצרו מנתונים לשגות זמן שנרכשו באמצעות מערכת זו ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר מקורות פלואורסצנטיים במקומות דיסקרטיים לאורך זמן כגון לוקליזציה אות שליח שני. יש לדאוג בעת שימוש במקורות אור רבי עוצמה כדי למנוע חשיפה לעיניים.
כמו כן, הקפד ללבוש כפפות נאותות בעת טיפול תוויות ביולוגיות.
