Bu protokol, tek bir örnekte birkaç floresan sinyali ayırmak için kullanılabilecek bir yöntemi tanımladığı için önemlidir. Geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, uyarma-tarama deneyin hızını artırabilir ve verilerin hassasiyetini artırabilir. Bu yöntem, süper süreklilik lazer gibi farklı aydınlatma kaynakları kullanılarak dönen disk veya lazer tarama konfokal mikroskop sistemleri için uygulanabilir.
Uyarma-tarama, spektral görüntüleme mikroskopisi yaparken, her floresan etiketin uyarma zirvesinin farklı bir dalga boyunda oluşunun olup olmadığını kontrol etmek önemlidir. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi ters floresan mikroskobu ve kamerayı ayarlayın. Sonra sahnede örnek yükleyin.
Micromanager ana penceresinin açılır menüsünden, ilk örnek görüntüleme için 475 nanometre seçin. Ardından pozlamanın yanındaki kutuya çift tıklayın ve pozlama süresini 100 milisaniye olarak ayarlamak için 100 girin. Son olarak, örneği görüntülemek için canlı'yı tıklatın.
Şimdi Otomatik'e tıklayın. Minimum ve maksimum değerleri anlamlı, görsel aralıklara getirmek için otomatik yoğunluk izleme aralığı düğmesi. Ardından, numuneyi odaklamak için mikroskobun odak tonlarını kullanın.
Odaklandıktan sonra, numunenin konumunu, kenarının görüş alanının merkezinde olacak şekilde ayarlayın. O zaman odakta ince ayar. Görüntüdeki kenar özellikleri keskin göründüğünde örnek odaktadır.
Şimdi, çok boyutlu edinme aracını açın. Menüde, yük düğmesini tıklatın ve spektral edinimi için uygun bir dalga boyu aralığı içeren önceden ayarlanmış bir ayar seçin. Edinme ayarları onaylandıktan sonra, numunenin boş bir bölgesine geçin ve daha sonra çıkarma için kullanılacak arka plan ve gürültü içeren bir spektral görüntü yığını toplamak için satın alın'ı tıklatın.
Ardından, en parlak bölgeleri bulmak için örnek hakkında hareket edin. Örneklerin, numunenin kenarından uzakta daha yoğun floresan olması muhtemeldir. En parlak bölge bulunduğunda, tek bir görüntü yığını alın.
Elde edilen görüntüyü Görüntü J'ye yükleyin ve hiçbir dalga boylarının aşırı pozlanmış piksel içermediğini doğrulamak için Image J'nin ölçüm işlevini kullanın. Aşırı pozlama nedeniyle daha az pozlama süresi gerekiyorsa, arka plan görüntüsü de yeni bir pozlama süresi ile geri alınmalıdır. Görüntülerden herhangi birinin kameranın yukarı algılama sınırını içerdiği tespit edilirse, spektral aralıkboyunca maksimum sinyalin kameranın dinamik aralığını aşmadığından emin olmak için spektral tarayın pozlama süresini ayarlayın.
Şimdi belirlenen uygun bir pozlama süresiyle, sahneye etiketlenmemiş bir örnek yerleştirin. Altta yatan bir otofloresence olup olmadığını belirlemek için etiketlenmemiş örnekten spektral görüntü verilerini edinin. Ardından, sahneye tek etiketli bir örnek yerleştirin.
Spektral kitaplık oluşturmak için spektral denetimolarak kullanmak üzere tek etiketli örneklerin her birinden spektral görüntü verileri edinin. Aynı dalga boyu aralığı pozlama süresi ve kamera ayarlarını kullanarak her kontrol numunesi için taramaya devam edin. Ardından, mikroskoba deneysel numuneiçeren bir slayt yerleştirin.
Hücreleri uygun şekilde etiketlemiş bir görünüm alanı seçin ve belirlenen edinme ayarlarını kullanarak örnekten spektral görüntü verilerini elde edin. Arka plan spektrumunu örnek görüntüden çıkararak ve görüntüyü düzeltme katsayısıyla çarparak görüntüleri düz bir spektral yanıta doğru layın. Burada, görüntüleri hızlı bir şekilde işlemek için bir MATLAB komut dosyası kullanılır.
Sonra, spektral kitaplığı oluşturun. En iyi sonuçlar için, hangi dalga boyu bandının en yoğun değere sahip olduğunu belirleyerek ve her dalga boyu bandındaki ölçümü bu maksimum değere bölerek her bir uç üyeyi en yüksek yoğunluktaki dalga boyu bandına normalleştirin. Sonra spektral verileri dat dosyası olarak kaydedin.
Tamamlandığında, spektral görüntü verilerini karıştırın. Karıştırmayı karıştırmaadım, her floresan etiket için bir bolluk görüntüsü oluşturur, burada bolluk, görüntüdeki göreli floresan sinyal miktarıdır. Ardından, saf bileşenlerin dağıtımını görsel olarak incelemek için her karışık olmayan görüntüyü açın.
Hata görüntüsünün büyüklüğünü karışık olmayan görüntülerle karşılaştırın. Hata görüntüsünün büyüklüğü karışık olmayan bolluk görüntülerine benziyorsa, spektral görüntü verilerindeki sinyaller doğru bir şekilde muhasebelemeyebilir. Son olarak, hata görüntüsünü karışık olmayan görüntülerle karşılaştırarak tanımlanamayan artık yapılar olup olmadığını denetleyin.
Doğru yapıldığında, spektral karıştırma işlemi, spektral görüntü yığınının her floresan etiketinden ilgili katkılara ayrılmasını sağlar. Burada, hava yolu düz kas hücre otofloresans vurgulayan bireysel görüntüler ile karışık olmayan bir spektral görüntü seti, bir GCaMP prob ve bir mitokondriyal etiket. Hücrelerin nükleer ve perinükleer bölgeleri ile ilişkili yüksek hata bu bölgelerin ölçülen spektrumları iyi spektral kütüphanede spektrumlar tarafından hesap olmadığını gösteren vardır.
Aynı zamanda otofloresan etiketli hücrelerden toplanan saf spektrumlar büyük olasılıkla saf bileşen için spektral profili kontamine olacaktır. Burada, bir otofloresan ile kontamine saf spektrumile karıştırma farkı görebilirsiniz, ölçekli çıkarma sonra düzeltilmiş saf spektrumları karşı. Hassas numunelerin görüntülenmesinde uygun veri toplama, arka plan ve yeniden görüntülenebilen kontrollerden farklı olarak tek bir görüntüleme seansı sağlanabilir.
Uygun donanım ve edinme ayarlarının mümkün olduğunca önceden belirlendiğinden emin olun. Bir sonraki adım olarak, bu sistem kullanılarak elde edilen hızlandırılmış verilerden oluşturulan videolar, ikinci haberci sinyali yerelleştirme gibi zaman içinde gizli konumlardaki floresan kaynakları izlemek için kullanılabilir. Göze maruz kalmaktan kaçınmak için güçlü ışık kaynaklarını kullanırken dikkatli olalım.
Ayrıca, biyolojik etiketleri kullanırken uygun eldiven giymek emin olun.
