Este protocolo es significativo, ya que describe un método que se puede utilizar para separar varias señales fluorescentes en una sola muestra. En comparación con los métodos tradicionales, excitación-escaneo puede aumentar la velocidad del experimento y mejorar la sensibilidad de los datos. Mediante el uso de diferentes fuentes de iluminación, como un láser supercontinuum, este método puede ser aplicable a los sistemas de microscopio confocal de escaneo láser o disco giratorio.
Al realizar escaneos de excitación, microscopía de imágenes espectrales, es importante comprobar que el pico de excitación de cada etiqueta fluorescente se produce a una longitud de onda diferente. Para empezar, configure un microscopio de fluorescencia invertido y una cámara como se describe en el protocolo de texto. A continuación, cargue la muestra en el escenario.
En el menú desplegable de la ventana principal del microrómetro, seleccione 475 nanómetros para la visualización inicial de la muestra. A continuación, haga doble clic en el cuadro situado junto a la exposición e introduzca 100 para establecer el tiempo de exposición en 100 milisegundos. Por último, haga clic en live para ver el ejemplo.
Ahora haga clic en Automático. El botón de rango de visualización de intensidad automática para llevar los valores mínimo y máximo a rangos visuales significativos. A continuación, utilice las perillas de enfoque del microscopio para enfocar la muestra.
Una vez en foco, ajuste la posición de la muestra para que su borde esté en el centro del campo de visión. A continuación, ajuste el enfoque. La muestra está enfocada cuando las entidades de borde de la imagen aparecen nítidas.
Ahora, abra la herramienta de adquisición multidimensional. En el menú, haga clic en el botón de carga y elija un ajuste preestablecido que contenga un rango de longitud de onda adecuado para la adquisición espectral. Una vez confirmada la configuración de adquisición, desplácese a una región en blanco de la muestra y haga clic en adquirir para recopilar una pila de imágenes espectrales que contenga el fondo y el ruido que se usará para restar más adelante.
A continuación, desplácese por la muestra para encontrar las regiones más brillantes. Es probable que las muestras tengan fluorescencia más intensa lejos del borde de la muestra. Una vez que se encuentra la región más brillante, tome una sola pila de imágenes.
Cargue la imagen adquirida en la imagen J y utilice la función de medición de la imagen J para confirmar que ninguna longitud de onda contiene píxeles sobreexpuestas. Si es necesario reducir el tiempo de exposición debido a la sobreexposición, la imagen de fondo también debe retomarse con un nuevo tiempo de exposición. Si se encontró que alguna de las imágenes contiene el límite de detección ascendente de la cámara, ajuste el tiempo de exposición del escaneo espectral para asegurarse de que la señal máxima en todo el rango espectral no exceda el rango dinámico de la cámara.
Con un tiempo de exposición adecuado ahora determinado, coloque una muestra sin etiquetar en el escenario. Adquiera datos de imagen espectral de la muestra sin etiquetar para determinar si hay autofluoresencia subyacente. A continuación, coloque una muestra de una sola etiqueta en el escenario.
Adquiera datos de imagen espectral de cada una de las muestras de una sola etiqueta para utilizarlos como controles espectrales para crear una biblioteca espectral. Realice el escaneo de cada muestra de control utilizando un tiempo de exposición de rango de longitud de onda idéntico y ajustes de la cámara. A continuación, coloque una diapositiva que contenga la muestra experimental en el microscopio.
Seleccione un campo de visión que haya etiquetado correctamente las celdas y adquiera los datos de imagen espectral de la muestra utilizando la configuración de adquisición determinada. Corrija las imágenes a una respuesta espectral plana restando el espectro de fondo de la imagen de muestra y multiplicando la imagen por el coeficiente de corrección. Aquí, se utiliza un script MATLAB para procesar rápidamente las imágenes.
A continuación, genere la biblioteca espectral. Para obtener mejores resultados, normalice cada miembro final a la banda de longitud de onda de mayor intensidad determinando qué banda de longitud de onda tiene el valor más intenso y dividiendo la medición en cada banda de longitud de onda por ese valor máximo. A continuación, guarde los datos espectrales como un archivo dat.
Cuando haya terminado, desmezcla los datos espectrales de la imagen. El paso de desmezcla generará una imagen de abundancia para cada etiqueta fluorescente, donde la abundancia es la cantidad de señal fluorescente relativa en la imagen de la etiqueta prospectiva. A continuación, abra cada imagen no mezclada para inspeccionar visualmente la distribución de componentes puros.
Compare la magnitud de la imagen de error con la de las imágenes no mezcladas. Si la magnitud de la imagen de error es similar a las imágenes de abundancia no mezcladas, es posible que las señales de los datos de la imagen espectral no se tenga en cuenta con precisión. Por último, compruebe que no hay estructuras residuales no identificadas comparando la imagen de error con las imágenes no mezcladas.
Cuando se realiza correctamente, el proceso de desmezcla espectral permite la separación de una pila de imagen espectral en las respectivas contribuciones de cada etiqueta de fluorescencia. Aquí, un conjunto de imágenes espectrales no mezcladas con imágenes individuales que resaltan la autofluorescencia de células musculares lisas de las vías respiratorias, una sonda GCaMP y una etiqueta mitocondrial. Hay un alto error asociado con las regiones nucleares y perinucleares de las células que indica que los espectros medidos de esas regiones no están bien contabilizados por los espectros de la biblioteca espectral.
Los espectros puros recogidos de células etiquetadas que también son autofluorescentes probablemente contaminarán el perfil espectral del componente puro. Aquí, se puede ver la diferencia de desmezcla con espectros puros contaminados con autofluorescencia, en comparación con los espectros puros corregidos después de la resta a escala. La adquisición adecuada de datos es esencial cuando se toman imágenes de muestras sensibles, ya que solo pueden sobrevivir a una sola sesión de imágenes a diferencia del fondo y los controles que se pueden volver a crear imágenes.
Asegúrese de que la configuración de hardware y adquisición adecuada esté predeterminada tanto como sea posible. Como siguiente paso, los vídeos creados a partir de datos de lapso de tiempo adquiridos con este sistema se pueden utilizar para rastrear fuentes fluorescentes en ubicaciones discretas a lo largo del tiempo, como la localización de la segunda señal de mensajero. Tenga cuidado al usar fuentes de luz potentes para evitar la exposición a los ojos.
Además, asegúrese de usar guantes adecuados al manipular etiquetas biológicas.
