このプロトコルは、1つのサンプルで複数の蛍光シグナルを分離するために使用できる方法を記述しているので重要です。従来の方法と比較して、励起スキャンは実験の速度を上げ、データの感度を向上させることができます。スーパーコンティニュムレーザーなどの異なる照明源を使用することにより、この方法は、回転ディスクまたはレーザー走査型共焦点顕微鏡システムに適用できる可能性があります。
励起走査を行う場合、分光イメージング顕微鏡は、各蛍光標識の励起ピークが異なる波長で発生することを確認することが重要である。まず、テキストプロトコルに記載されているように、反転蛍光顕微鏡とカメラを設置します。その後、ステージ上でサンプルをロードします。
マイクロマネージャーメインウィンドウのドロップダウンメニューから、最初のサンプル表示用に475ナノメートルを選択します。次に、露出の横にあるボックスをダブルクリックし、「100」と入力して、露出時間を 100 ミリ秒に設定します。最後に、[ライブ] をクリックしてサンプルを表示します。
今すぐ[自動]をクリックします。最小および最大値を意味のある視覚的な範囲に持ち込むための自動強度表示範囲ボタン。次に、顕微鏡のフォーカスノブを使用してサンプルをフォーカスします。
フォーカスが入ったら、サンプルの位置を調整して、視野の中央にエッジが表示されるようにします。次に、フォーカスを微調整します。イメージ内のエッジ フィーチャがシャープに見えるとき、サンプルはフォーカスされます。
次に、多次元取得ツールを開きます。メニューで、ロードボタンをクリックし、スペクトル取得に適した波長範囲を含むプリセット設定を選択します。取得設定が確認されたら、サンプルの空白の領域に移動し、取得をクリックして、後で減算に使用する背景とノイズを含むスペクトル画像スタックを収集します。
次に、サンプルを動かして最も明るい領域を見つけます。サンプルは、サンプルの端から離れてより強い蛍光を持っている可能性があります。最も明るい領域が見つかったら、単一の画像スタックを取ります。
取得した画像をイメージJにロードし、画像Jの測定機能を使用して、露光過多のピクセルを含む波長がないことを確認します。露出過多のために露出時間を短縮する必要がある場合は、背景画像も新しい露光時間で再撮影する必要があります。いずれかの画像にカメラの上方検出限界が含まれていることが判明した場合は、スペクトルスキャンの露光時間を調整して、スペクトル範囲全体の最大信号がカメラのダイナミックレンジを超えないようにします。
適切な露光時間が決定された時点で、ラベルなしサンプルをステージに配置します。ラベルなしのサンプルからスペクトル画像データを取得し、基礎となる自己蛍光が存在するかどうかを判断します。次に、単一ラベルのサンプルをステージに配置します。
スペクトル ライブラリを構築するためのスペクトル コントロールとして使用する、単一ラベルの各サンプルからスペクトル 画像データを取得します。同一の波長範囲露光時間とカメラ設定を使用して、各制御サンプルのスキャンを実行します。次に、実験試料を含むスライドを顕微鏡に置く。
適切にラベル付けされたセルを持つ視野を選択し、決定された取得設定を使用してサンプルからスペクトル画像データを取得します。サンプル画像から背景スペクトルを引き、補正係数を掛けて画像を平らなスペクトル応答に補正します。ここでは、MATLAB スクリプトを使用して、画像を迅速に処理します。
次に、スペクトルライブラリを生成します。最良の結果を得るには、どの波長バンドが最も強い値を持つかを決定し、各波長帯域の測定値をその最大値で割ることによって、各端部材を最大強度の波長帯域に正規化します。次に、スペクトルデータを dat ファイルとして保存します。
完了したら、スペクトル画像データのミックスを解除します。アンミックスステップは、各蛍光標識に対して豊富な画像を生成し、その存在量は、見込みラベルからの画像中の相対的な蛍光シグナルの量である。次に、各未混合画像を開いて、純粋な成分の分布を視覚的に検査します。
エラー画像の大きさを、混合されていない画像の大きさと比較します。誤差画像の大きさが混ざり合っていない画像と類似している場合、スペクトル画像データ内の信号が正確に考慮されないことがあります。最後に、未混合画像とエラー画像を比較して、未確認の残存構造がないことを確認します。
正しく実行すると、スペクトル非混合プロセスにより、スペクトル画像スタックを各蛍光ラベルからのそれぞれの寄与に分離することができます。ここで、気道平滑筋細胞自家蛍光を強調する個々の画像を用いて設定された未混合スペクトル画像、GCaMPプローブおよびミトコンドリア標識を示す。スペクトルライブラリ内のスペクトルによって測定されたスペクトルが十分に考慮されないことを示す細胞の核および核周領域に関連する高い誤差がある。
また、自己蛍光である標識細胞から収集された純粋なスペクトルは、純粋成分のスペクトルプロファイルを汚染する可能性があります。ここで、自己蛍光で汚染された純粋なスペクトルと、スケール減算後の補正された純スペクトルとの混合解除の違いを見ることができる。適切なデータ取得は、バックグラウンドや再イメージ化される可能性のあるコントロールとは異なり、1回のイメージングセッションしか生き残ることもできないので、機密サンプルをイメージングする際に不可欠です。
ハードウェアと取得の適切な設定が、可能な限り事前に決められていることを確認します。次のステップとして、このシステムを使用して取得したタイムラプスデータから作成されたビデオを使用して、第2のメッセンジャー信号局在化などの時間の経過とともに控えめな場所で蛍光源を追跡することができます。強力な光源を使用して目の露出を避けるには注意してください。
また、生物学的ラベルを取り扱う際には、必ず適切な手袋を着用してください。
