Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine Methode beschreibt, die verwendet werden kann, um mehrere fluoreszierende Signale in einer einzigen Probe zu trennen. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden kann das Anregungsscannen die Geschwindigkeit des Experiments erhöhen und die Empfindlichkeit der Daten verbessern. Durch die Verwendung verschiedener Beleuchtungsquellen, wie z. B. eines Superkontinuumlasers, kann diese Methode auf Spinnscheiben- oder Laserscanning-Konfokalmikroskopsysteme anwendbar sein.
Bei der Durchführung von Anregungsscans, der spektralen Bildgebungsmikroskopie, ist es wichtig zu überprüfen, ob der Anregungsspitzenwert jedes fluoreszierenden Etiketts bei einer anderen Wellenlänge auftritt. Richten Sie zunächst ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop und eine Kamera ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Dann laden Sie die Probe auf die Bühne.
Wählen Sie im Dropdown-Menü des Mikromanager-Hauptfensters 475 Nanometer für die erstmalige Probenanzeige aus. Doppelklicken Sie dann auf das Feld neben der Belichtung und geben Sie 100 ein, um die Belichtungszeit auf 100 Millisekunden einzustellen. Klicken Sie schließlich auf Live, um das Beispiel anzuzeigen.
Klicken Sie nun auf Auto. Die Schaltfläche für den automatischen Intensitätsbereich, um die minimalen und maximalen Werte in aussagekräftige visuelle Bereiche zu bringen. Verwenden Sie als Nächstes die Fokusknöpfe des Mikroskops, um die Probe zu fokussieren.
Passen Sie nach dem Fokus die Position des Beispiels so an, dass sich die Kante in der Mitte des Sichtfelds befindet. Dann feinabstimmen den Fokus. Das Beispiel steht im Fokus, wenn die Kanten-Features im Bild scharf erscheinen.
Öffnen Sie nun das mehrdimensionale Erfassungstool. Klicken Sie im Menü auf die Ladetaste, und wählen Sie eine voreingestellte Einstellung aus, die einen geeigneten Wellenlängenbereich für die Spektralerfassung enthält. Nachdem die Erfassungseinstellungen bestätigt wurden, wechseln Sie zu einem leeren Bereich der Probe, und klicken Sie auf Abrufen, um einen Spektralbildstapel zu sammeln, der Hintergrund und Rauschen enthält, der später für die Subtraktion verwendet werden soll.
Bewegen Sie sich dann in der Stichprobe, um die hellsten Bereiche zu finden. Proben haben wahrscheinlich eine intensivere Fluoreszenz afern vom Rand der Probe. Sobald sich der hellste Bereich befindet, nehmen Sie einen einzelnen Bildstapel.
Laden Sie das aufgenommene Bild in Bild J, und verwenden Sie die Messfunktion von Bild J, um zu bestätigen, dass keine Wellenlängen überbelichtete Pixel enthalten. Wenn eine reduzierte Belichtungszeit aufgrund einer Überbelichtung erforderlich ist, sollte das Hintergrundbild auch mit einer neuen Belichtungszeit zurückgenommen werden. Wenn eines der Bilder die Aufwärtserkennungsgrenze der Kamera enthält, passen Sie die Belichtungszeit des Spektralscans an, um sicherzustellen, dass das maximale Signal im gesamten Spektralbereich den Dynamikbereich der Kamera nicht überschreitet.
Wenn nun eine angemessene Belichtungszeit ermittelt wird, legen Sie eine unbeschriftete Probe auf die Bühne. Erfassen Sie spektrale Bilddaten aus der nicht beschrifteten Probe, um festzustellen, ob eine zugrunde liegende Autofluoresenz vorhanden ist. Legen Sie dann eine einbeschriftete Probe auf die Bühne.
Erfassen Sie spektrale Bilddaten aus jedem der einzeln beschrifteten Samples, um sie als Spektralsteuerelemente zum Erstellen einer Spektralbibliothek zu verwenden. Führen Sie den Scan für jede Kontrollprobe mit einer identischen Belichtungszeit des Wellenlängenbereichs und Kameraeinstellungen durch. Legen Sie als Nächstes ein Dia mit der experimentellen Probe auf das Mikroskop.
Wählen Sie ein Sichtfeld aus, das zellenentsprechend beschriftet hat, und erfassen Sie die Spektralbilddaten aus der Stichprobe mithilfe der ermittelten Erfassungseinstellungen. Korrigieren Sie Bilder auf eine flache spektrale Reaktion, indem Sie das Hintergrundspektrum vom Beispielbild subtrahieren und das Bild mit dem Korrekturkoeffizienten multiplizieren. Hier wird ein MATLAB-Skript verwendet, um die Bilder schnell zu verarbeiten.
Generieren Sie als Nächstes die Spektralbibliothek. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, normalisieren Sie jedes Endelement auf das Wellenlängenband der größten Intensität, indem Sie bestimmen, welches Wellenlängenband den intensivsten Wert hat, und die Messung bei jedem Wellenlängenband durch diesen Maximalwert dividieren. Speichern Sie dann die Spektraldaten als dat-Datei.
Wenn sie abgeschlossen sind, entvermischen Sie die Spektralbilddaten. Der Unmixing-Schritt erzeugt ein Häufigkeitsbild für jedes fluoreszierende Etikett, wobei Die Häufigkeit die Menge des relativen Fluoreszenzsignals im Bild vom prospektiven Etikett ist. Öffnen Sie anschließend jedes ungemischte Bild, um die Verteilung reiner Komponenten visuell zu überprüfen.
Vergleichen Sie die Größe des Fehlerbildes mit der Größe der nicht gemischten Bilder. Wenn die Größe des Fehlerbildes den ungemischten Häufigkeitsbildern ähnelt, werden Signale in den Spektralbilddaten möglicherweise nicht genau berücksichtigt. Überprüfen Sie schließlich, ob keine nicht identifizierten Residuenstrukturen vorhanden sind, indem Sie das Fehlerbild mit den nicht gemischten Bildern vergleichen.
Bei korrekter Verarbeitung ermöglicht der spektrale Unmixprozess die Trennung eines Spektralbildstapels in die jeweiligen Beiträge von jedem Fluoreszenzetikett. Hier ein ungemischter Spektralbildmitmittmit, der auf die glatte Muskelzellautofluoreszenz der Atemwege hinweist, eine GCaMP-Sonde und ein mitochondriales Etikett. Es gibt einen hohen Fehler, der mit den kerntechnischen und perinuklearen Regionen der Zellen verbunden ist, was darauf hindeutet, dass die gemessenen Spektren dieser Regionen nicht gut durch die Spektren in der Spektralbibliothek berücksichtigt werden.
Reine Spektren, die aus beschrifteten Zellen gesammelt werden, die auch autofluoreszierend sind, werden wahrscheinlich das Spektralprofil für die reine Komponente kontaminieren. Hier kann man den Unterschied der Unmischung mit reinen Spektren sehen, die mit Autofluoreszenz kontaminiert sind, im Vergleich zu den korrigierten reinen Spektren nach skalierter Subtraktion. Die richtige Datenerfassung ist bei der Abbildung empfindlicher Proben unerlässlich, da sie im Gegensatz zum Hintergrund und den Steuerelementen, die möglicherweise neu abgebildet werden, nur eine einzelne Bildgebungssitzung überstehen.
Stellen Sie sicher, dass die richtigen Hardware- und Erfassungseinstellungen so weit wie möglich vorgegeben sind. Als nächster Schritt können Videos, die aus Zeitrafferdaten erstellt wurden, die mit diesem System erfasst wurden, verwendet werden, um fluoreszierende Quellen an diskreten Orten im Laufe der Zeit zu verfolgen, z. B. durch die Lokalisierung des zweiten Messenger-Signals. Achten Sie darauf, wenn Sie leistungsstarke Lichtquellen verwenden, um Augeneinwirkung zu vermeiden.
Achten Sie auch darauf, beim Umgang mit biologischen Etiketten die richtigen Handschuhe zu tragen.
