이 프로토콜은 단일 샘플에서 여러 형광 신호를 분리하는 데 사용할 수있는 방법을 설명하므로 중요합니다. 기존의 방법에 비해, 흥분 스캐닝은 실험 속도를 높이고 데이터의 민감도를 향상시킬 수 있습니다. 초응축 레이저와 같은 다른 조명 원을 사용하여, 이 방법은 회전 디스크 또는 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템에 적용 될 수있다.
각 형광성 라벨의 발근 피크가 다른 파장에서 발생하는지 확인하는 것이 중요합니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 반전형 형광 현미경 및 카메라를 설정합니다. 그런 다음 스테이지에서 샘플을 로드합니다.
마이크로 매니저 메인 창의 드롭다운 메뉴에서 초기 샘플 보기를 위해 475 나노미터를 선택합니다. 그런 다음 노출 옆 의 상자를 두 번 클릭하고 100을 입력하여 노출 시간을 100 밀리초로 설정합니다. 마지막으로 라이브를 클릭하여 샘플을 봅니다.
이제 자동을 클릭합니다. 최소 값과 최대 값을 의미 있는 시각적 범위로 가져오는 자동 강도 보기 범위 버튼입니다. 다음으로 현미경의 초점 노브를 사용하여 샘플을 집중시하십시오.
포커스가 되면 샘플의 위치를 조정하여 가장자리가 시야의 중심에 있도록 합니다. 그런 다음 포커스를 미세 조정합니다. 이미지의 가장자리 피쳐가 선명해 보일 때 샘플이 초점이 맞춰져 있습니다.
이제 다차원 수집 도구를 엽니다. 메뉴에서 로드 버튼을 클릭하고 스펙트럼 획득을 위해 적절한 파장 범위를 포함하는 사전 설정 설정을 선택합니다. 획득 설정이 확인되면 샘플의 빈 영역으로 이동하고 획득을 클릭하여 나중에 빼기에 사용할 배경 및 노이즈가 포함된 스펙트럼 이미지 스택을 수집합니다.
그런 다음 샘플을 이동하여 가장 밝은 영역을 찾습니다. 견본은 견본의 가장자리에서 멀리 더 강렬한 형광이 있기 위하여 확률이 높습니다. 가장 밝은 영역이 있는 후에는 단일 이미지 스택을 가져 가십시오.
획득한 이미지를 이미지 J에 로드하고 이미지 J의 측정 기능을 사용하여 파장이 과다 노출된 픽셀을 포함하지 않는지 확인합니다. 과다 노출로 인해 노출 시간이 단축되면 배경 이미지도 새 노출 시간으로 다시 가져와야 합니다. 카메라의 위쪽 검출 한계를 포함하는 이미지가 발견되면 스펙트럼 스캔의 노출 시간을 조정하여 스펙트럼 범위 전체의 최대 신호가 카메라의 동적 범위를 초과하지 않도록 합니다.
적절한 노출 시간이 이제 결정되면 레이블이 지정되지 않은 샘플을 스테이지에 배치합니다. 레이블이 지정되지 않은 샘플에서 스펙트럼 이미지 데이터를 수집하여 기본 자동 불발성이 있는지 확인합니다. 그런 다음 단 하나 레이블이 표시된 샘플을 스테이지에 배치합니다.
스펙트럼 라이브러리를 구축하기 위해 스펙트럼 컨트롤로 사용할 단일 레이블이 표시된 각 샘플에서 스펙트럼 이미지 데이터를 수집합니다. 동일한 파장 범위 노출 시간 및 카메라 설정을 사용하여 각 제어 샘플에 대한 스캔을 수행합니다. 다음으로, 현미경에 실험 샘플을 포함하는 슬라이드를 놓는다.
셀에 적절하게 레이블이 지정된 뷰 필드를 선택하고 결정된 획득 설정을 사용하여 샘플에서 스펙트럼 이미지 데이터를 수집합니다. 샘플 이미지에서 배경 스펙트럼을 빼고 보정 계수에 의해 이미지를 곱하여 평평한 스펙트럼 응답에 이미지를 수정합니다. 여기에서 MATLAB 스크립트를 사용하여 이미지를 신속하게 처리합니다.
다음으로 스펙트럼 라이브러리를 생성합니다. 최상의 결과를 위해 각 엔드 멤버를 가장 강렬한 값을 가지는 파장 대역을 결정하고 각 파장 대역에서 측정값을 최대 값으로 나누어 최상의 강도의 파장 대역으로 정규화합니다. 그런 다음 스펙트럼 데이터를 dat 파일로 저장합니다.
완료되면 스펙트럼 이미지 데이터를 혼합 해제합니다. 혼합 해제 단계는 각 형광 라벨에 대한 풍부한 이미지를 생성하며, 여기서 풍부하게 는 잠재 레이블의 이미지에서 상대형 형광 신호의 양입니다. 다음으로 혼합되지 않은 각 이미지를 열어 순수 부품의 분포를 시각적으로 검사합니다.
오류 이미지의 크기를 혼합되지 않은 이미지의 크기와 비교합니다. 오류 이미지의 크기가 혼합되지 않은 풍부 이미지와 유사한 경우 스펙트럼 이미지 데이터의 신호가 정확하게 설명되지 않을 수 있습니다. 마지막으로 오류 이미지를 혼합되지 않은 이미지와 비교하여 확인되지 않은 잔류 구조가 없는지 확인합니다.
올바르게 수행하면 스펙트럼 언믹싱 프로세스를 통해 스펙트럼 이미지 스택을 각 형광 레이블의 기여로 분리할 수 있습니다. 여기에서, 기도 원활한 근육 세포 자동 형광, GCaMP 프로브 및 미토콘드리아 라벨을 강조하는 개별 이미지와 함께 혼합되지 않은 스펙트럼 이미지 세트. 세포의 핵 및 perinuclear 영역과 관련된 높은 오차가 있는데, 이는 해당 지역의 측정된 스펙트럼이 스펙트럼 라이브러리의 스펙트럼에 의해 잘 설명되지 않는다는 것을 나타낸다.
또한 자동 형광인 표지된 세포에서 수집된 순수한 스펙트럼은 순수 성분에 대한 스펙트럼 프로파일을 오염시킬 가능성이 높습니다. 여기서, 하나는 스케일드 뺄셈 후 수정 된 순수한 스펙트럼대, 자동 불발으로 오염 된 순수한 스펙트럼과 혼합해제의 차이를 볼 수 있습니다. 적절한 데이터 수집은 중요한 샘플을 이미징할 때 필수적이며, 이는 다시 이미지될 수 있는 배경 및 컨트롤과는 달리 단일 이미징 세션에서만 살아남을 수 있기 때문에 필수적입니다.
적절한 하드웨어 및 획득 설정이 가능한 한 미리 결정되었는지 확인합니다. 다음 단계로, 이 시스템을 사용하여 획득한 타임랩스 데이터에서 생성된 비디오를 사용하여 제2 메신저 신호 현지화와 같은 시간이 지남에 따라 신중한 위치에서 형광원을 추적할 수 있습니다. 눈 노출을 피하기 위해 강력한 광원을 사용할 때주의하십시오.
또한 생물학적 라벨을 취급할 때 적절한 장갑을 착용하십시오.
