הפרוטוקול שלנו מתאר את השינוי הגנטי של תא CAR-T במהלך הייצור שלהם באמצעות טכנולוגיית CRISPR כדי ליצור מוצר יעיל יותר ופחות רעיל. היתרון של טכניקה זו הוא כי ייצור תא CAR-T ומניפולציה גנטית יכולים להתרחש בתא אחד עם יעילות טובה. הדגימה של ההליך תהיה רוזלי סטרנר, דוקטורנטית לרפואה, מישל קוקס, טכנולוגית וסטודנטית לתואר שני, וראונה סאקורה, פוסט דוקטורטורית, מהמעבדה שלי.
לאחר בידוד תאי T מתאים חד-גרעיניים של דם היקפי שנקטפו, התחל ללטף אותם על-ידי הכנת מדיום תאי T ולאחר מכן עיקורו על-ידי סינונו באמצעות מסנן ואקום סטרילי של 0.45 מיקרומטר ולאחר מכן באמצעות מסנן ואקום סטרילי של 0.22 מיקרומטר. ביום של גירוי תא T או יום אפס, לפני הגירוי, לשטוף חרוזי CD3/CD28 על ידי הצבת נפח הנדרש של חרוזים בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר ו resuspending במיליליטר אחד של TCM. מניחים את הצינור במגע עם מגנט לדקה אחת.
לאחר מכן שאפו את ה- TCM והקדישו מיליליטר אחד של TCM טרי לשטוף שוב את החמרוזים ולחזור על סך של שלוש שטיפות. ולבסוף, תן שימוש חוזר גם את חרוזים במיליליטר אחד של TCM. לאחר ספירת תאי ה- T, העבר את חרוזים לתאי T ביחס של שלושה עד חרוזים אחד לתאים.
לאחר מכן לדלל את התאים לריכוז סופי של מיליון תאים למיליליטר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 במשך 24 שעות. לאחר רכישת מבנה CART19 בווקטור lentiviral, לבצע ייצור lentiviral על ידי הדגירה הראשונה lentiviral פלסמיד, וקטור אריזה, וקטור מעטפה, reagent precomplexing, reagent transfection, ו מדיום transfection בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לבצע עבודה lentiviral באמצעות BSL2 + אמצעי זהירות כולל מכסה המנוע תרבות התא, ציוד מגן אישי, וחיטוי של חומרים משומשים עם אקונומיקה לפני סילוק.
לאחר הדגירה, הוסיפו את אותם רה-גנטים טרנספקטיים ל-293 תאי T שהגיעו ל-70%-90% קונפלונציה ותרבות התאים המרובים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. ב 24 ו 48 שעות לאחר transfection, קציר, צנטריפוגה, לסנן ולרכז על טבעי המכיל וירוסים על ידי אולטרה צנטריפוגה להקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. ביום הראשון, תן שימוש חוזר בעדינות בתאי T שעוררו במיליון תאים למיליליטר ביום אפס כדי לשבור את רוזט התאים.
תחת אמצעי זהירות מתאימים BSL2+, להוסיף וירוס טרי או קפוא שנקטפו לתאי T מדומה בריבוי של זיהום של 3.0. המשך להדרגר את תאי T מתומרים ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2. בימים 3 ו-5, לספור תאי CAR-T ולהוסיף TCM מחומם מראש טרי לתרבות כדי לשמור על ריכוז תא CAR-T של מיליון תאים למיליליטר.
שישה ימים לאחר הסימולציה, להסיר חרוזים מן תאי T מתומרים על ידי קציר הראשון ו resuspending התאים. מעבירים את התאים בצינורות חרוטיים 50 מיליליטר ומ מניחים את הצינורות במגנט למשך דקה אחת. לאחר איסוף CAR-T תא המכיל supernatant והשליכת חרוזים, למקם את התאים בחזרה בתרבות בריכוז של מיליון תאים למיליליטר בבקבוק תרבות.
השתמש בדגימת תאים עבור ציטומטריית זרימה כדי להעריך את ביטוי פני השטח של רשות האישורים. הדגירה את השאר כדי לחדש את ההתרחבות ולאחר מכן לקצור ול Cryo-לשמר את התאים ביום שמונה כמתואר בכתב היד. כדי לשבש את הגורם מגרה מושבת מקרופאג גרנולוציטים, השתמש במדריך RNA כמתואר בכתב היד.
דגירה reagents transfection בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הוסיפו אותם ל-293 תאי T שהגיעו ל-70%-90% קונפלונציה ותרבות התאים המפוסלים ב-37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 כדי לייצר lentivirus. ב 24 ו 48 שעות, לקצור ולרכז וירוס המכיל על טבעי על ידי אולטרהצנטריפוגציה ב 50 צינורות אולטרהצנטריפוגה מיליליטר להקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
ואז ביום הראשון, בעדינות להשתמש בתאי T כדי לשבור רוזטות. במעבדה מאושרת BSL2+, כדי ליצור תאי CAR-T, להוסיף CAR19 lentivirus ו- GMCSF מיקוד CRISPR lentivirus לתאי T מדומה. ביום השלישי והיום החמישי עבור תאי T שנערכו בהצלחה על ידי lentiCRISPR הנושאים עמידות לפורומיצין, לטפל בתאים עם puromycin דיהידרוכלוריד בריכוז של מיקרוגרם אחד של puromycin למיליליטר.
רצף הגאות שימש כדי לאשר הפחתת GM-CSF בתאי CART19 נוקאאוט GM-CSF עם יעילות שיבוש של כ 71% זרימה חלקות של כתם משטח תא CAR-T מגודר על תאים חיוביים CD3 לחיות להראות כי הן פראי סוג CART19 ו- GM-CSF נוקאאוט CART19 בהצלחה ובאופן דומה לבטא את קולטן משטח CAR במבחנה. מצד שני, כתמים תאיים של GM-CSF על ידי ציטומטריה זרימה גם מגודר על תאים חיוביים CD3 חי מדגים ביטוי מופחת של GM-CSF בתאי הנוקאאוט לעומת תאי CART19 מסוג בר המאשרים הצלחה תפקודית של הנוקאאוט. טיפול מסוים צריך להילקח במהלך שלבי ההעתקה של הליך זה כפי שהם הקריטיים ביותר להתפתחות של תאי CAR-T מהונדסים גנטית.
המתודולוגיה המתוארת עשויה להיות מיושמת על מגוון גנים כדי לשנות תאי CAR-T באמצעות CRISPR /CAS9 כדי לעזור ליצור מוצר פחות רעיל ויעיל יותר. טכנולוגיית CRISPR/CAS9 מספקת את האסטרטגיות למקד ישירות את הגנום של תאי CAR-T כדי להנדס פתרונות לחסרונות הקליניים הנוכחיים.
