בין מספר פרוטוקולים קיימים להכנת רקמות עבור מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, בחרנו שיטות המניבים שימור מבני אופטימלי מיקרוגרפים ברזולוציה גבוהה לבצע ניתוח מורפומטרי של הפצת וריסקים סינפטית במסופים presynaptic. תמונות החדות הגבוהה המתקבלות בשיטות אלה מאפשרות לכמת פרמטרים כגון מרחק של ווסיקים סינפטיים ממספר הממברנה הקדם-סינפטית של וריקלים שעגנו בממברנה הקדם-סינפטית ומרחקים בין-וריים. כל הפרמטרים האלה מעידים על פונקציה סינפטית.
מאז שינויים בארגון המרחבי של תנודות סינפטיות עשוי להיות קשור עם שיבוש של תפקוד סינפטי, שיטות אלה שימשו כדי לבחון את ההשפעות של הרדמה כללית על התפתחות סינפטית. שיטות אלה יכולות לשמש גם כדי לבחון את ההשפעות של כל תרופה או טיפול על המורפולוגיה המפורטת של הסינפסות כדי לספק תובנה על תפקודם. התחל על ידי הכנת osmium tetroxide עבור קיבעון פוסט של חלקי מוח חולדה קבוע בעבר עם paraformaldehyde ו glutaraldehyde באמצעות זלוב כלי דם.
חלקים הופכים נוקשים לאחר הטיפול עם אוסמיניום tetroxide. לכן טיפול ברקמות דורש תשומת לב מאז. כמו כן, לפני הוספת אוסמיניום, ודא כי החלקים שלך הם שטוחים כמו כל קיפול עלול לגרום שבר ברקמות.
פתחו אמפולת זכוכית אחת של 4% אוסיום טטרוקסיד ומים והפילו אותה בתוך בקבוק זכוכית חום. הוסף חמישה מיליליטר של חיץ פוספט טוחן 0.2 ולאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר נוספים של 0.1 מאגר פוספט טוחן כדי להשיג פתרון 1%הסופי. השתמש מזרק 20 מיליליטר מצויד מחט ארוכה כדי לצייר את 1% osmium tetroxide ולאחר מכן להוסיף את osmium tetroxide לצנצנת זכוכית חומה מכוסה רדיד אלומיניום.
לאחר שוודאו שהדגימה נפרשת ושטחה, הוסיפו 1%osmium tetroxide ו-PB טוחנת 0.1 לבקבוקון הדגימה. דגירה הדגימה ב osmium tetroxide במשך שעה בטמפרטורת החדר. מוציאים את אוסמינום טטרוקסיד עם micropipet לאחר הדגירה הוא סיים ולשטוף את החלקים כמתואר בפרוטוקול.
להכנת אצטט אורניל, מניחים בקבוק זכוכית נפחי 200 מיליליטר המכיל 100 מיליליטר של 70% אתנול על צלחת ערבוב. מוסיפים ארבעה גרם של אצטט אורניל לבקבוק, עוטפים רדיד אלומיניום כדי למנוע משקעים על ידי אור ומערבבים ברציפות. ייבשו את החלקים באתנול של 50%.
הכתם עם אצטט 4% אורניל מוכן במשך שעה אחת ולעקוב עם התייבשות סדרתית שטיפה כמתואר בכתב היד. הסר את הבוכנה מזרק מזרק 60 מיליליטר gavage ולכסות אותו עם מחט בטיחות. מקם את המזרק עם הצד הפתוח למעלה ולהוסיף כל מרכיב של תערובת שף אחד אחד.
סיים על-ידי הוספת 525 מיקרוליטרים של DMP30 עם צינור. הזזת הבוכנה של הצינור לאט מאוד כמו DMP הוא צמיג מאוד. שים את הבוכנה בחזרה במזרק.
הפוך את המזרק כמה פעמים כדי לערבב את התוכן. הצבע ישתנה מצהוב לענבר. לפנות את האוויר בתוך המזרק.
ואז למקם אותו על נדנדה עם רעידות רצופות לפחות 30 דקות. מוסיפים כרך אחד של שרף אפוקסי ונפח אחד של אצטון לבקבוקון scintillation ומנערים לערבב. החל את זה על שף אחד על תערובת אצטון על סעיף הרקמה לאחר שטיפה אצטון האחרון שמירה מכוסה, כדי למנוע אידוי אצטון.
מוציאים את התערובת אחת לתערובת של שף ואצטון לאחר שעתיים עד ארבע שעות ומחליפים אותו בשרף מלא ודגירה במשך ארבע שעות. שים את כל פסולת שרף במיכל איסוף מתחת למכסה המנוע כדי פולימריזציה ולהיפטר מאוחר יותר. חותכים שתי חתיכות מלבניות של סרט polychlorotrifluoroethylene ברור ולנגב אותם עם 70% אתנול.
לקצץ אותם כך שיש לפחות 1.5 ס"מ של פלסטיק ללא רקמות בכל צד של החלק, לוודא שיש להם את אותו רוחב אבל הגובה של הסדין על גבי הוא כ 2/3 של הגיליון התחתון. להטות לאט את הבקבוקון ולהשתמש מכחול גמלים עדין מיקרו מרית גמישה מאוד בעדינות להרים את הדגימה מלמטה. לאחר מכן הזיזו בזהירות את המקטע לאורך קירות הבקבוקון והעברו לגיליון PCTFE התחתון.
הסר עודף שף עם מיקרו מרית בעדינות לכסות את הדגימה עם הגיליון העליון. בעדינות לדחוף את כל בועות אוויר לכודים מבלי להפעיל לחץ ישיר על סעיף הרקמה ולמחוק את השד העודף. השתמש בעט עמיד ממס כדי לתייג את הסדינים ומניחים בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך יומיים עד שלושה ימים כדי פולימריזציה.
יש לפרק בעדינות את גיליונות ה-PCTFE הכריכים כדי לפתוח אותם. השתמש בעט עמיד ממס כדי לסמן את הצד של הגיליון המכיל את סעיף ההיאבקות המסמן אותו ליד הרקמה. השתמש בניקוב דיסק כדי לקבל דגימה מעגלית של המקטע כדי לוודא שסימן העט הוא חלק מהרקמות החבוטות.
סימן העט ינצץ כשהאור יזרח על הדגימה. מניחים את המכסה של צד קפסולה הטבעה על מחזיק כמוסה. מניחים טיפת שף על המכסה ומכניסים את הדיסק החבוט לתוך המכסה כשקטע הרקמה פונה כלפי מעלה.
הכנס כמוסה לתוך הכובע באמצעות תנועת חולץ פקקים עדינה. השתמש פינצטה עדין לגלגל ולהוריד פיסת נייר מודפסת באורך שני סנטימטרים לתוך הקפסולה, לוודא שהוא מתאים עקמומיות של הקירות הצדדיים של הקפסולה. יוצקים את שף הטבעה בתוך הקפסולה, למלא עד קצה הקפסולה ולהשתמש במקל עץ מחודד לדחוף את דגימת הרקמה למטה לתחתית.
מניחים את הקפסולה בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך יומיים עד שלושה ימים עבור פיסול. ואז להמשיך עם חתך וכתמים כמתואר בפרוטוקול. מיקרוגרף אלקטרונים של שימור משביע רצון של מבנה התא העצבי מראה קרום תאים שכבתי ללא הפסקות.
הציטופלסמה היא סוף סוף פרטנית וללא חללים ריקים. המיטוכונדריה אינה נפוחה ואינה מכווצת עם קרום כפול בחוץ שמור וכריסטה פנימית שלמה. שימור אופטימלי של מבנה עצבי אולטרה-מבנה ופרטים מורפולוגיים עדין הוא חיוני על מנת לדמיין ולדקלים סינפטיים ולמדוד את המרחק שלהם מן הממברנה presynaptic.
וקסיקים סינפטיים צריכים להיות מובחנים ומרופדים על ידי קרום יחיד רצוף. על מנת להקל על ניתוח מורפומטרי של התפלגות קדחת סינפטית, ממברנות פרסינפטיות ופוסט-סינפטיות צריכות להיות מקבילות בהמשכיות שלהן. מיקרוגרף אלקטרונים של שימור פגום של מבנה הרקמות מראה את העיוות והשבירה של קרום התא העצבי ואת נוכחותם של חללים חוץ תאיים מוגדלים במידה ניכרת.
המיטוכונדריה נראית נפוחה ויש לה כריסטה נפוחה. בדוגמה נוספת לשימור מבנה רקמות פגום, היו חללים ריקים לבנים גדולים בתוך הציטופלסמה במקום חומר ציטופלסמי גרגירי דק עם חללים חוץ תאיים מוגדלים. קרום מלאכותי כמו forall ככל הנראה נבע גיוס של שומנים במהלך הקיבעון עם glutaraldehyde.
כאשר עובדים רקמת מוח צעירה להשתמש 1 חיץ פוספט טוחן כממס עבור כל הפתרון שלך, כך שאתה שומר על טוניק קרוב ככל האפשר לזה של המוח חולדה שזה עתה נולד למזער הצטמקות רקמות חפצים או נפיחות. ניתן להשתמש במיקרוגרפים המתקבלים בשיטות אלה כדי לחקור את המורפולוגיה המפורטת ואת היחסים המבניים הממדיים של מספר רכיבים תאיים מלבד וריסקים סינפטיים. לדוגמה, מיטוכונדריה, מנגנון גולגי וכרומטין גרעיני.
מספר שלבים בפרוטוקול זה דורשים כימיקלים שיכולים להיות רעילים. תמיד לעבוד תחת מכסה המנוע אדים ללבוש ציוד מגן אישי בעת טיפול אלדהידים, אוסיום, אורניום ותרכובות עופרת.
