İletim elektron mikroskobu için doku hazırlığı için mevcut birçok protokol arasında, presinaptik terminallerde sinaptik vezikül dağılımının morfometrik analizini yapmak için optimal yapısal koruma ve yüksek çözünürlüklü mikrograflar sağlayan yöntemler seçtik. Bu yöntemlerle elde edilen yüksek kontrastlı görüntüler, presinaptik membrana kenetlenmiş vezikül sayısı nın sinaptik veziküllerin uzaklığı ve inter vezikül uzaklıkları gibi parametrelerin ölçülmesine olanak sağlar. Tüm bu parametreler sinaptik fonksiyonun göstergesidir.
Sinaptik veziküllerin mekansal organizasyonundaki değişiklikler sinaptik fonksiyonun bozulması ile ilişkili olabileceğinden, bu yöntemler genel anesteziklerin sinaptik gelişim üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Bu yöntemler aynı zamanda herhangi bir ilaç veya tedavinin sinapsların ayrıntılı morfolojisi üzerindeki etkilerini incelemek ve işlevleri hakkında bilgi sağlamak için de kullanılabilir. Daha önce vasküler perfüzyon yoluyla paraformaldehit ve glutaraldehit ile sabit sıçan beyin bölümlerinin post fiksasyon için osmiyum tetroksit hazırlayarak başlayın.
Osmiyum tetroksit ile tedavi den sonra kesitler sertleşir. Bu nedenle doku kullanımı o andan itibaren dikkat gerektirir. Ayrıca, osmiyum eklemeden önce, herhangi bir kat büyük olasılıkla doku kırığı neden olacak gibi bölümleri düzleştirilmiş olduğundan emin olun.
Açık bir beş mililitre cam ampul 4% osmium tetroksit ve su ve kahverengi bir cam şişe içine bırakın. 0.2 molar fosfat tampon beş mililitre ekleyin ve sonra% 1 nihai çözüm elde etmek için 0,1 molar fosfat tampon ek 10 mililitre ekleyin. % 1 osmiyum tetroksit çizmek ve daha sonra alüminyum folyo ile kaplı kahverengi bir cam kavanoza osmiyum tetroksit eklemek için uzun bir iğne ile donatılmış 20 mililitrelik şırınga kullanın.
Numunenin açılıp düzleştirilmiş olduğundan emin olduktan sonra numune şişesine %1 ozmiyum tetroksit ve 0,1 molar PB ekleyin. Numuneyi oda sıcaklığında bir saat boyunca osmium tetroksit ile kuluçkaya yatırın. Kuluçka bittikten sonra osmiyum tetroksiti mikropipetle ayıklayın ve protokolde açıklandığı gibi bölümleri durulayın.
Uranyal asetat hazırlamak için, karıştırma plakası üzerinde 100 mililitre %70 etanol içeren 200 mililitrelik hacimsel cam şişesi yerleştirin. Şişeye dört gram uranyl asetat ekleyin, ışıkla yağış önlemek için alüminyum folyo sarın ve sürekli karıştırın. % 50 etanol bölümleri dehydrate.
Bir saat için hazırlanan% 4 uranyl asetat ile leke ve seri dehidratasyon ve durulama ile takip el yazması açıklandığı gibi. Şırınga pistonu 60 mililitrelik bir gavaj şırıngasından çıkarın ve bir güvenlik iğnesi ile kap. Şırıngayı açık tarafı yla yerleştirin ve resenin her bir bileşenini tek tek ekleyin.
Bir pipet ile 525 mikrolitre DMP30 ekleyerek bitirin. DMP olarak pipet in pistonu çok yavaş hareket ettirilmesi çok viskoz. Pistonu şırıngaya geri koy.
İçeriği karıştırmak için şırıngayı birkaç kez ters çevirin. Renk sarıdan kehribara değişecek. Şırınganın içindeki havayı boşaltın.
Sonra en az 30 dakika boyunca sürekli sallayarak bir rocker üzerine yerleştirin. Bir sintillasyon vial epoksi reçine ve aseton bir hacim ekleyin ve karıştırmak için sallayın. Aseton buharlaşmasını önlemek için kapalı tutmak son aseton durulama sonra doku bölümünde aseton karışımı için bir reçine uygulayın.
2-4 saat sonra rezorin ve aseton bire bir karışımını çıkarın ve dört saat boyunca tam rezorn ve kuluçka ile değiştirin. Polimerize ve daha sonra bertaraf edilecek kaput altında bir toplama kabına tüm reçin atık koyun. Net poliklorotrifloroetilen film iki dikdörtgen parçalar kesin ve% 70 etanol ile silin.
Bölümün her tarafında en az 1,5 santimetre dokusuz plastik olacak şekilde kırpın, aynı genişliğe sahip olurlar ancak üstteki levhanın yüksekliği alt sayfanın yaklaşık 2/3'üdür. Yavaşça şişeyi yatırın ve numuneyi alttan yavaşça kaldırmak için ince bir deve boya fırçası ve esnek bir mikro spatula kullanın. Sonra dikkatle şişe duvarları boyunca bölümü hareket ettirin ve alt PCTFE levha üzerine aktarın.
Bir mikro-spatula ile fazla reçiyiyi çıkarın ve numuneyi yavaşça üst levhayla kapatın. Yavaşça doku bölümüne doğrudan basınç uygulamadan herhangi bir sıkışık hava kabarcıkları dışarı itin ve aşırı reçine silmek. Levhaları etiketlemek için çözücüye dayanıklı bir kalem kullanın ve polimerize etmek için 2-3 gün boyunca 60 santigrat derecede bir fırına yerleştirin.
Yavaşça onları açmak için sandviç PCTFE levhalar çekin. Dokunun yakınını işaretleyen yapıştırıcı bölümü içeren sayfanın yan tarafını işaretlemek için çözücüye dayanıklı bir kalem kullanın. Kalem işaretinin delinmiş dokunun bir parçası olduğundan emin olmak için bölümün daire örneğini almak için bir disk zımba kullanın.
Kalem işareti, numunenin üzerinde ışık parladığında parlayacak. Gömme kapsül tarafının kapağını kapsül tutucuya yerleştirin. Kapağın üzerine bir damla rekarin yerleştirin ve zımbalı diski dokunun yukarı bakacak şekilde kapağın içine takın.
Hafif bir tirbuşon hareketi kullanarak kapağın içine bir kapsül yerleştirin. Kapsülün yan duvarlarının eğimine uyduğundan emin olmak için, yazdırılmış iki santimetre uzunluğundaki kağıt etiketparçasını kapsülün içine yuvarlamak ve düşürmek için ince cımbız kullanın. Kapsül içine gömme resin dökün, kapsül kenarına kadar doldurun ve alt doku örneği aşağı itmek için sivri bir ahşap sopa kullanın.
Polimerizasyon için 2-3 gün boyunca 60 derece santigrat de fırında kapsül yerleştirin. Ve sonra protokolde açıklandığı gibi kesit ve boyama ile devam edin. Nöronal hücre yapısının tatmin edici korunması elektron mikrografı, tabakalı hücre zarlarını kırılmadan gösterir.
Sitoplazma nihayet tanecikli ve boş alanlar olmadan. Mitokondri ne şişmiş ne de korunmuş bir dış çift membran ve bozulmamış iç cristae ile küçülmüş. Sinaptik vezikülleri görselleştirmek ve presinaptik membrandan uzaklıklarını ölçmek için nöronal ultrayapının ve ince morfolojik detayların optimum şekilde korunması esastır.
Sinaptik veziküller farklı olmalı ve kırılmamış tek bir zar ile kaplı olmalıdır. Sinaptik vezikül dağılımının morfometrik analizini kolaylaştırmak için presinaptik ve postsinaptik membranların sürekliliği korunmalıdır. Doku yapısının kusurlu korunmasının elektron mikrografı nöronal hücre zarlarının bozulmasını ve kırılmasını ve belirgin şekilde genişlemiş hücre dışı boşlukların varlığını gösterir.
Mitokondri şişmiş görünür ve şişmiş cristae var. Kusurlu doku yapısının korunmasının bir başka örneğinde, genişlemiş hücre dışı boşluklara sahip ince granüler sitoplazma maddesi yerine sitoplazma içinde büyük beyaz boş alanlar vardı. Glutaraldehit ile fiksasyon sırasında lipidlerin mobilizasyonu sonucu ortaya çıkan yapay bir membran.
Genç beyin dokusu çalışırken tüm çözüm için bir çözücü olarak 1 molar fosfat tampon kullanın böylece yenidoğan sıçan beynine mümkün olduğunca yakın tonicity tutmak ve artmen doku büzülme ve şişme en aza indirmek. Bu yöntemlerle elde edilen mikrograflar, sinaptik veziküller dışındaki bir dizi hücresel bileşenin ayrıntılı morfolojisi ve boyutsal yapısal ilişkilerini incelemek için kullanılabilir. Örneğin, mitokondri, golgi aparatı ve nükleer kromatin.
Bu protokoldeki birkaç adım toksik olabilecek kimyasallar gerektirir. Her zaman bir duman başlık altında çalışmak ve aldehitler, osmiyum, uranyum ve kurşun bileşikleri ele kişisel koruyucu ekipman giymek.
