Entre vários protocolos existentes para preparação de tecidos para microscopia eletrônica de transmissão, selecionamos métodos que produzem preservação estrutural ideal e micrografos de alta resolução para realizar a análise morfósica da distribuição de vesículas sináptica em terminais pré-sinápticos. As imagens de alto contraste obtidas com esses métodos permitem quantificar parâmetros como distância de vesículas sinápticas do número de membrana pré-sináptica de vesículas ancoradas na membrana pré-sináptica e distâncias interéculas. Todos esses parâmetros são indicativos de função sináptica.
Uma vez que alterações na organização espacial de vesículas sinápticas podem estar associadas à interrupção da função sináptica, esses métodos têm sido usados para examinar os efeitos dos anestésicos gerais no desenvolvimento sináptico. Esses métodos também poderiam ser usados para examinar os efeitos de qualquer droga ou tratamento sobre a morfologia detalhada das sinapses para fornecer insights sobre sua função. Comece preparando tetroxida de ósmio para pós fixação de seções cerebrais de ratos previamente fixadas com paraformaldeído e glutaraldeído via perfusão vascular.
As seções ficam rígidas após o tratamento com tetroxida de ósmio. Portanto, o manuseio de tecidos requer atenção a partir de então. Além disso, antes de adicionar ósmio, certifique-se de que suas seções estão achatadas, pois qualquer dobra provavelmente resultará em fratura tecidual.
Abra uma ampola de vidro de cinco mililitros de 4%de tetroxida de ósmio e água e solte-a dentro de uma garrafa de vidro marrom. Adicione cinco mililitros de tampão de fosfato molar de 0,2 e adicione 10 mililitros adicionais de tampão fosfato molar de 0,1 para alcançar uma solução final de 1%. Use uma seringa de 20 mililitros equipada com uma agulha longa para elaborar o tetroxida de 1%osmium e, em seguida, adicione o tetroxida de ósmio a um frasco de vidro marrom coberto com papel alumínio.
Depois de certificar-se de que a amostra foi desdobrada e achatada, adicione 1%de tetroxida de ósmio e 0,1 pb molar ao frasco de espécime. Incubar o espécime em tetroxida de ósmio por uma hora em temperatura ambiente. Extrair o tetroxida de ósmio com um micropipet após a incubação estiver concluída e enxaguar as seções conforme descrito no protocolo.
Para preparar o acetato deuranyl, coloque um frasco de vidro volumoso de 200 mililitros contendo 100 mililitros de 70% de etanol em uma placa de agitação. Adicione quatro gramas de acetato de urílico ao frasco, enrole uma folha de alumínio para evitar a precipitação pela luz e mexa continuamente. Desidratar as seções em 50% de etanol.
Mancha com o acetato de 4%de urano por uma hora e segue com desidratação serial e lavagem como descrito no manuscrito. Remova o êmbolo da seringa de uma seringa de 60 mililitros e tampe-a com uma agulha de segurança. Posicione a seringa com o lado aberto e adicione cada ingrediente da mistura de resina um a um.
Finalize adicionando 525 microliters de DMP30 com uma pipeta. Mover o êmbolo da tubulação muito lentamente como DMP é muito viscoso. Coloque o êmbolo de volta na seringa.
Inverta a seringa algumas vezes para misturar o conteúdo. A cor mudará de amarelo para âmbar. Evacuar o ar dentro da seringa.
Em seguida, coloque-o em um roqueiro com agitação contínua por pelo menos 30 minutos. Adicione um volume de resina epóxi e um volume de acetona a um frasco de cintilação e agite para misturar. Aplique esta uma em uma resina na mistura de acetona na seção de tecido após a última enxágüe de acetona mantendo-se coberta para evitar a evaporação de acetona.
Remova o de uma mistura de resina e acetona após duas a quatro horas e substitua-a por resina completa e incuba por quatro horas. Coloque todos os resíduos de resina em um recipiente de coleta sob o capô para polimerizar e ser descartado posteriormente. Corte duas peças retangulares de filme de policlorotrifluoroetileno claro e limpe-as com 70% de etanol.
Apare-os para que haja pelo menos 1,5 centímetro de plástico sem tecido em todos os lados da seção, certificando-se de que eles têm a mesma largura, mas a altura da folha em cima é aproximadamente 2/3 da folha inferior. Incline lentamente o frasco e use um pincel de camelo fino e uma micro-espátula flexível para levantar suavemente o espécime do fundo. Em seguida, mova cuidadosamente a seção ao longo das paredes do frasco e transfira para a folha inferior PCTFE.
Remova o excesso de resina com uma micro-espátula e cubra suavemente o espécime com a folha superior. Empurre suavemente todas as bolhas de ar presas sem aplicar pressão direta na seção tecidual e elimine o excesso de resina. Use uma caneta resistente ao solvente para rotular as folhas e coloque em um forno a 60 graus celsius durante dois a três dias para polimerizar.
Retire delicadamente as folhas PCTFE sanduíches para abri-las. Use uma caneta resistente ao solvente para marcar o lado da folha que contém a seção de adesão que a marca perto do tecido. Use um soco de disco para obter uma amostra de círculo da seção certificando-se de que a marca da caneta faz parte do tecido perfurado.
A marca da caneta brilhará quando a luz estiver brilhando no espécime. Coloque a tampa de uma cápsula de incorporação lado para cima em um suporte de cápsula. Coloque uma gota de resina na tampa e insira o disco perfurado dentro da tampa com a seção de tecido voltada para cima.
Insira uma cápsula na tampa usando um movimento suave de saca-rolhas. Use pinças finas para enrolar e baixar um pedaço de papel impresso de dois centímetros de comprimento na cápsula, certificando-se de que ele se encaixa na curvatura das paredes laterais da cápsula. Despeje a resina de incorporação dentro da cápsula, encha até a borda da cápsula e use uma vara de madeira pontiaguda para empurrar o espécime de tecido até o fundo.
Coloque a cápsula no forno a 60 graus celsius durante dois a três dias para polimerização. E então continuar com secção e coloração como descrito no protocolo. O micrografo eletrônico de preservação satisfatória da estrutura celular neuronal mostra membranas celulares em camadas sem rupturas.
O citoplasma é finalmente granular e sem espaços vazios. Mitocôndrias não estão inchadas nem encolhidas com uma membrana dupla externa conservada e cristae interna intacta. A preservação ideal da ultraestrutura neuronal e dos detalhes morfológicos finos é essencial para visualizar vesículas sinapáticas e medir sua distância da membrana pré-sináptica.
As vesículas sinápticas devem ser distintas e forradas por uma membrana única ininterrupta. Para facilitar a análise morfométrica da distribuição de vesículas sinápticas, as membranas pré-sinápticas e postsinásticas devem ser paralelas em sua continuidade preservada. O micrografo eletrônico de preservação defeituosa da estrutura tecidual mostra a distorção e quebra das membranas celulares neuronais e a presença de espaços extracelulares significativamente ampliados.
Mitocôndrias parecem distendidas e têm cristae inchada. Em outro exemplo de preservação da estrutura tecidual defeituosa, havia grandes espaços vazios brancos dentro do citoplasma no lugar de substância citoplasmática finamente granular com espaços extracelulares ampliados. Uma membrana artificial como tudo provavelmente resultou da mobilização de lipídios durante a fixação com glutaraldeído.
Ao trabalhar, o tecido cerebral jovem usa 1 tampão de fosfato molar como solvente para toda a sua solução para que você mantenha a tônica o mais próxima possível da cérebro de rato recém-nascido e minimize o encolhimento e ou inchaço do tecido artefactual. Os micrografos obtidos com esses métodos podem ser usados para estudar a morfologia detalhada e as relações estruturais dimensionais de uma série de componentes celulares que não sejam vesículas sinápticas. Por exemplo, mitocôndrias, aparelhos golgi e cromatina nuclear.
Várias etapas deste protocolo requerem produtos químicos que podem ser tóxicos. Sempre trabalhe sob um capô de fumaça e use equipamentos de proteção individual ao manusear aldeídos, osmium, urânio e compostos de chumbo.
