Среди нескольких существующих протоколов подготовки тканей к передаче электронной микроскопии мы выбрали методы, которые дают оптимальное структурное сохранение и микрографы высокого разрешения для выполнения морфометрического анализа распределения синаптических пузырьков на пресинаптических терминалах. Высококонтрастные изображения, полученные с помощью этих методов, позволяют количественно определить параметры, такие как расстояние синаптических пузырьков от пресинаптической мембраны, количество пузырьков, пристыкованная к пресинаптической мембране, и межвезикулярные расстояния. Все эти параметры свидетельствуют о синаптической функции.
Поскольку изменения в пространственной организации синаптических пузырьков могут быть связаны с нарушением синаптической функции, эти методы были использованы для изучения влияния общей анестезии на синаптической развития. Эти методы также могут быть использованы для изучения влияния любого препарата или лечения на подробную морфологию синапсов, чтобы дать представление об их функции. Начните с подготовки осмия тетроксида для постфиксации крысиных секций мозга, ранее зафиксированных параформальдегидом и глутаралдегидом с помощью сосудистой перфузии.
Разделы становятся жесткими после лечения осмий тетроксидом. Поэтому обработка тканей требует внимания с тех пор. Кроме того, прежде чем добавлять осмий, убедитесь, что ваши разделы сплющены, как и любой раз, скорее всего, приведет к перелому тканей.
Откройте одну пятими миллилитровую стеклянную ампулу 4%osmium тетроксида и воды и опустите его в коричневую стеклянную бутылку. Добавьте пять миллилитров 0,2 молярного фосфатного буфера, а затем добавьте дополнительные 10 миллилитров буфера толярного фосфата 0,1 для достижения 1%окончательного решения. Используйте 20 миллилитров шприц оснащен длинной иглой, чтобы составить 1%osmium тетроксида, а затем добавить осмий тетроксида в коричневую стеклянную банку, покрытую алюминиевой фольгой.
Убедившись, что образец был развернут и сплющен, добавьте 1%osmium тетроксид и 0,1 молярного PB к флакону образца. Инкубировать образец в осмий тетроксида в течение одного часа при комнатной температуре. Извлекайте осмий тетроксид с помощью микропайпа после окончания инкубации и промойте секции, как описано в протоколе.
Для приготовления уранилового ацетата поместите на помешивая тарелку 200 миллилитров объемной стеклянной колбы, содержащей 100 миллилитров 70%этанола. Добавьте в колбу четыре грамма уранилового ацетата, оберните алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить осадки светом, и непрерывно перемешайте. Обезвоживать секции в 50% этанола.
Пятно с подготовленным 4%уранил ацетат в течение одного часа и следовать с серийным обезвоживанием и полоскания, как описано в рукописи. Снимите поршень шприца с 60-миллилитрового шприца и крышка его с иголкой безопасности. Распоимите шприц с открытой стороной вверх и добавьте каждый ингредиент смеси смолы один за другим.
Закончите, добавив 525 микролитров DMP30 с пипетки. Перемещение поршень трубы очень медленно, как DMP очень вязкий. Положите поршень обратно в шприц.
Переверните шприц несколько раз, чтобы смешать содержимое. Цвет будет меняться от желтого до янтаря. Эвакуируйте воздух внутри шприца.
Затем поместите его на рокер с непрерывной тряской, по крайней мере 30 минут. Добавьте один том эпоксидной смолы и один том ацетона в сцинтилляционный флакон и встряхните, чтобы перемешать. Применить это один к одному смолы ацетон смеси на ткани разделе после последнего ацетона промыть сохраняя в покрыты, чтобы избежать испарения ацетона.
Удалите один к одной смеси смолы и ацетона через два-четыре часа и заменить его полной смолы и инкубировать в течение четырех часов. Положите все отходы смолы в контейнер для сбора под капотом, чтобы полимеризировать и быть утилизированы позже. Вырезать два прямоугольных кусков ясной полихлортороэтиленовой пленки и протрите их 70%этанола.
Обрезать их так, что есть по крайней мере 1,5 сантиметра ткани без пластика на каждой стороне раздела, убедившись, что они имеют ту же ширину, но высота листа на вершине составляет примерно 2/3 от нижней части листа. Медленно наклоните флакон и используйте тонкую верблюжью кисть и гибкий микро-шпатель, чтобы очень осторожно поднять образец со дна. Затем осторожно переместите секцию вдоль стенок флакона и перенесите на нижний лист PCTFE.
Удалите излишки смолы с помощью микро-шпателя и аккуратно накройте образец верхним листом. Аккуратно выталкивайте любые захваченные пузырьки воздуха, не применяя прямого давления на секцию ткани и уничтожайте излишки смолы. Используйте растворительную ручку для маркировки листов и поместите в духовку при температуре 60 градусов по Цельсию в течение двух-трех дней для полимеризации.
Аккуратно разъедать зажатые листы PCTFE, чтобы открыть их. Используйте растворитель устойчивый перо, чтобы отметить сторону листа, который содержит придерживаясь раздел маркировки его вблизи ткани. Используйте диск удар, чтобы получить образец круга раздела убедившись, что перо знак является частью выкоутой ткани.
Знак пера будет блестеть, когда свет светит на образец. Поместите крышку встраиваемой капсулы вверх на держатель капсулы. Поместите каплю смолы на крышку и вставьте пробитый диск внутри крышки с тканью раздел лицом вверх.
Вставьте капсулу в крышку, используя нежное движение штопор. Используйте тонкие пинцеты, чтобы свернуть и опустить напечатанный двухметровый лист бумаги этикетки в капсулу, убедившись, что он подходит для кривизны боковых стенок капсулы. Налейте встраиваемую смолу внутри капсулы, заполните до края капсулы и используйте остроконечную деревянную палку, чтобы подтолкнуть образец ткани на дно.
Поместите капсулу в духовку при температуре 60 градусов по Цельсию в течение двух-трех дней для полимеризации. А затем продолжить раздел и окрашивание, как описано в протоколе. Электронный микрограф удовлетворительного сохранения структуры нейронных клеток показывает слоистые клеточные мембраны без перерывов.
Цитоплазма, наконец, гранулированная и без пустых пространств. Митохондрии не опухли и не сморщены с сохранением внешней двойной мембраны и нетронутыми внутренними cristae. Оптимальное сохранение нейрональной ультраструктуры и тонкой морфологической детализации имеет важное значение для визуализации синаптических пузырьков и измерения их расстояния от пресинаптической мембраны.
Синаптические пузырьки должны быть отчетливыми и выстилаться непрерывной одной мембраной. Для облегчения морфометрического анализа распределения синаптических пузырьков, пресинаптические и постсинаптические мембраны должны быть параллельными в их непрерывности сохраняется. Электронный микрограф дефектного сохранения структуры тканей показывает искажение и поломку мембран нейронных клеток и наличие заметно увеличенных внеклеточных пространств.
Митохондрии кажутся разтянуты и имеют опухшие cristae. В другом примере сохранения дефектной структуры тканей, были большие белые пустые пространства в цитоплазме вместо мелко гранулированного цитоплазмического вещества с увеличенными внеклеточными пространствами. Искусственная мембрана, как forall вероятно, в результате мобилизации липидов во время фиксации с глутаралдегидом.
При работе молодой ткани мозга использовать 1 молярный фосфатный буфер в качестве растворителя для всех ваших решений, так что вы держите тоник как можно ближе к новорожденному мозгу крысы и свести к минимуму усадку тканей и / или опухоль. Микрографы, полученные с помощью этих методов, могут быть использованы для изучения детальной морфологии и мерных структурных связей ряда клеточных компонентов, помимо синаптических пузырьков. Например, митохондрии, аппарат голги и ядерный хроматин.
Несколько шагов в этом протоколе требуют химических веществ, которые могут быть токсичными. Всегда работайте под дымовым капотом и носите средства индивидуальной защиты при обращении с альдегидами, осмием, ураном и свинцовыми соединениями.
