전염 전자 현미경 검사법을 위한 조직 준비를 위한 몇몇 기존 프로토콜 중, 우리는 사전 시냅스 단자에서 시냅스 소포 분포의 형태측정 분석을 능력을 발휘하기 위하여 최적 구조 보존 및 고해상도 현미경 을 산출하는 방법을 선택했습니다. 이러한 방법으로 얻은 고대비 이미지는 사전 시냅스 막 및 간 소포 거리에 도킹된 소포의 사전 시냅스 멤브레인 수로부터의 시냅스 소포의 거리와 같은 파라미터를 정량화할 수 있게 한다. 이러한 모든 매개 변수는 시냅스 함수를 나타냅니다.
시냅스 소포의 공간 적 조직에 있는 변경은 시냅스 기능의 중단과 연관될 수 있기 때문에, 이러한 방법은 시냅스 발달에 대한 일반적인 마취제의 효력을 검사하기 위하여 이용되었습니다. 이러한 방법은 또한 그들의 기능에 대 한 통찰력을 제공 하기 위해 시 냅 스의 상세한 형태에 어떤 약물 또는 치료의 효과 검사 하는 데 사용할 수 있습니다. 이전에 혈관 관류를 통해 파라 포름알데히드와 글루타랄데히드로 고정 쥐 뇌 섹션의 포스트 고정을 위한 osmium 테트록사이드를 준비하 음 부로 시작합니다.
섹션은 osmium 테트산화물로 치료 후 강성된다. 따라서 조직 처리는 그 때부터 주의가 필요합니다. 또한 osmium을 추가하기 전에 어떤 주름이 조직 골절로 인해 평평해졌는지 확인하십시오.
4%의 오스뮴 테트옥사이드와 물의 5밀리리터 유리 앰뮬을 열고 갈색 유리 병 안에 떨어뜨립니다. 0.2 개의 어금니 산염 버퍼의 5 밀리리터를 추가한 다음 0.1 개의 어금반 버퍼의 10 밀리리터를 추가하여 1 % 최종 솔루션을 달성하십시오. 긴 바늘이 장착된 20 밀리리터 주사기를 사용하여 1% 오스뮴 테트옥사이드를 그린 다음 알루미늄 호일로 덮인 갈색 유리 항아리에 오스뮴 테트옥사이드를 추가합니다.
시편이 전개되고 평평해졌는지 확인한 후, 시편 바이알에 1%오스뮴 테트옥사이드와 0.1 어금니 PB를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 osmium 테트옥사이드에서 표본을 배양하십시오. 인큐베이션이 완료된 후 마이크로파이프로 오스뮴 테트옥사이드를 추출하고 프로토콜에 설명된 바와 같이 단면을 헹구는다.
uranyl 아세테이트를 준비하려면 교반 접시에 70%에탄올 100밀리리터가 들어 있는 200밀리리터 체피 유리 플라스크를 놓습니다. 플라스크에 4그램의 우라닐 아세테이트를 넣고 알루미늄 호일을 감싸빛으로 강수량을 방지하고 지속적으로 저어줍니다. 50%에탄올로 단면을 탈수합니다.
1 시간 동안 4 %의 uranyl 아세테이트를 준비 한 스테인은 원고에 설명 된 바와 같이 연쇄 탈수 및 헹구기를 따릅니다. 60 밀리리터 게이지 주사기에서 주사기 플런저를 제거하고 안전 바늘로 캡. 주사기를 열린 면으로 놓고 수지 믹스의 각 성분을 하나씩 추가합니다.
파이프와 DMP30의 525 마이크로 리터를 추가하여 마무리합니다. DMP가 매우 점성이 있기 때문에 파이프의 플런저를 매우 느리게 이동합니다. 플런저를 주사사기에 다시 넣습니다.
주사기를 몇 번 반전하여 내용을 혼합합니다. 색상은 노란색에서 황색으로 변경됩니다. 주사기 내부의 공기를 대피시다.
그런 다음 적어도 30 분 동안 연속 흔들림으로 로커에 놓습니다. 에폭시 수지 1부와 아세톤 1부로 환멸바이알을 넣고 흔들어 섞어줍니다. 아세톤 증발을 피하기 위해 덮여 마지막 아세톤 린스 후 조직 섹션에 아세톤 혼합물에 하나의 수지에 이 것을 적용하십시오.
2~4시간 후에 수지와 아세톤의 혼합물을 제거하고 전체 수지로 교체하고 4시간 동안 배양합니다. 모든 수지 폐기물을 후드 아래에 수거 용기에 넣고 중합하고 나중에 폐기하십시오. 투명 폴리 클로로트리플루오로로틸렌 필름 의 두 직사각형 조각을 잘라 70 %에탄올로 닦아.
섹션의 모든 측면에 티슈가 없는 플라스틱이 1.5센티미터 이상 되도록 트리밍하여 너비가 동일하지만 상단시트의 높이는 아래시트의 약 2/3입니다. 바이알을 천천히 기울이고 미세한 낙타 페인트 브러시와 유연한 마이크로 주걱을 사용하여 바닥에서 표본을 매우 부드럽게 들어 올립니다. 그런 다음 조심스럽게 유리병 벽을 따라 섹션을 이동하고 하단 PCTFE 시트로 전송합니다.
마이크로 주걱으로 여분의 수지를 제거하고 부드럽게 상단 시트로 표본을 덮습니다. 티슈 섹션에 직접 압력을 가하지 않고 갇힌 기포를 부드럽게 밀어 내고 과도한 수지를 닦아냅니다. 용매 내성 펜을 사용하여 시트에 라벨을 부착하고 오븐에 60도의 오븐에 넣고 2~3일 동안 중합합니다.
샌드위치된 PCTFE 시트를 부드럽게 떼어 내어 엽니다. 용매 내성 펜을 사용하여 조직 근처에 표시하는 서납 절이 들어 있는 시트의 측면을 표시합니다. 디스크 펀치를 사용하여 펜 마크가 펀치 아웃 조직의 일부인지 확인하는 섹션의 원 샘플을 얻습니다.
표본에 빛이 비추면 펜 마크가 빛난다. 캡슐 홀더에 캡슐 측의 캡슐 캡을 올려 놓습니다. 캡에 수지 한 방울을 놓고 티슈 섹션이 위를 향하여 캡 내부에 펀치 디스크를 삽입합니다.
부드러운 코르크 스크류 무브먼트를 사용하여 캡슐을 캡에 삽입합니다. 미세한 핀셋을 사용하여 캡슐에 인쇄된 2센티미터 길이의 종이 라벨을 롤앤하느라 캡슐의 측면 벽의 곡률에 맞는지 확인합니다. 캡슐 내부에 포함 된 수지를 붓고 캡슐의 가장자리까지 채우고 뾰족한 나무 막대기를 사용하여 조직 표본을 바닥으로 밀어 넣습니다.
중합을 위해 2 ~3 일 동안 60섭씨에 캡슐을 오븐에 놓습니다. 그런 다음 프로토콜에 설명된 대로 단면화 및 염색을 계속합니다. 신경 세포 구조의 만족스러운 보존의 전자 현미경 사진은 휴식없이 층화된 세포막을 보여줍니다.
세포질은 마침내 세분화되고 빈 공간이 없습니다. 미토콘드리아는 부어오르거나 수축되지 않으며 보존된 외부 이중 멤브레인과 그대로 내부 cristae로 축소되지 않습니다. 시냅스 소포를 시각화하고 사전 시냅스 멤브레인에서의 거리를 측정하기 위해서는 신경 초구조학적 미세 구조와 미세한 형태학적 세부 사항의 최적의 보존이 필수적입니다.
시냅스 소포는 뚜렷하고 깨지지 않는 단일 멤브레인에 의해 줄 지어 있어야합니다. 시냅스 소포 분포의 형태학적 분석을 용이하게 하기 위해서는 사전 시냅틱 및 포스트냅스 멤브레인이 유지되는 연속성에서 평행해야 합니다. 조직 구조의 결함 보존의 전자 현미경 사진은 신경 세포막의 왜곡 및 파손과 현저하게 확대 된 세포 외 공간의 존재를 보여줍니다.
미토콘드리아는 불만을 토로하고 부은 크리스테를 가지고 있다. 결함이 있는 조직 구조 보존의 또 다른 예에서는 세포세포 공간이 확대된 미세하게 세분화된 세포질 물질 대신 세포질 내의 큰 흰색 빈 공간이 있었습니다. 인공 막은 글루타랄데히드로 고정하는 동안 지질의 동원으로 인해 발생할 가능성이 높습니다.
젊은 뇌 조직을 작업 할 때 1 어금니 인산염 버퍼를 모든 용액용용으로 사용하여 신생아 쥐 뇌의 뇌에 가능한 한 가깝게 토니시티를 유지하고 관절 조직 수축 및 또는 붓기를 최소화하십시오. 이러한 방법으로 얻은 현미경 그래프는 시냅스 소포 이외의 다수의 세포 성분의 상세한 형태및 차원 구조 관계를 연구하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아, 골기 장치 및 핵 크로마틴.
이 프로토콜의 여러 단계는 독성이 있을 수 있는 화학 물질이 필요합니다. 알데히드, 오스뮴, 우라늄 및 납 화합물을 취급할 때 항상 연기 후드 아래에서 작업하고 개인 보호 장비를 착용하십시오.
