כאן יישמו microinjection של RNAs שכותרתו פלואורסצנטי לזהות רצפי RNA אשר חיוניים לוקליזציה של RNAs גרעיניים קצרים לתוך מבנים גרעיניים הנקראים גופים Cajal. לטכניקה זו יש שני יתרונות עיקריים. ראשית, ניתן להחיל אותו על RNAs קצרים שאחרת קשה לסמן ולעקוב אחריהם.
ושנית, זה מאפשר סינון מהיר של רצפים שונים ובדיקת תפקידם לוקליזציה RNA. יום אחד לפני microinjection, זרעי HeLa או תאים חסידים אחרים על 12 מילימטר מכסה כדי להגיע 50% confluency בזמן microinjection. כדי להתחיל, למקם כיסוי מוכן למרכז צלחת פטרי, להוסיף תאים ושני מילימטרים של מדיה תרבותית.
למחרת, מניחים את צלחת פטרי מלא התא על שלב מיקרוסקופ. באמצעות microloader, לטעון שלושה microliters של תערובת snRNA לתוך המחט ולהתקין את המחט לתוך המחזיק של microinjector בזווית של 45 מעלות ביחס לפני השטח של צלחת פטרי. השתמש במטרה 10X למרחקים ארוכים כדי למצוא את המחט.
ראשית, להגדיר את המהירות גסה על המזרק ולהוריד את המחט עד שהוא נוגע במדיום התרבות. באמצעות משקפת מיקרוסקופ, למצוא את נקודת האור שהוא המקום שבו המחט נוגעת באמצעי התרבות. לשנות את המהירות כדי לקנוס ולהוריד עוד יותר את המחט תוך כדי התבוננות לתוך המיקרוסקופ עד קצה המחט הוא ציין.
להזיז את המחט באמצע השדה החזותי ולעבור למטרה 40X למרחקים ארוכים. לאחר מכן, בחר את התא והזז את המחט מעל התא. הגדר את הלחץ והזמן עבור איש הקשר הסלולרי.
להזיז את המחט למטה לתוך התא ולאחר מכן להגדיר את הגבול התחתון של micromanipulator. הגדרת הגבול התחתון היא החלק הקריטי ביותר בפרוטוקול. בגלל משטח coverslip אינו מושלם, כי כל תא שונה, תצטרך להגדיר את הגבול התחתון מספר פעמים במהלך הפעלת ההזרקה.
לאחר מכן, להזיז את המחט בחזרה מעל התא ולחץ על כפתור ההזרקה על מוט ההיגוי של המזרק. המחט תעבור באופן אוטומטי בתוך התא למקום שבו הגבול מוגדר להזריק את תערובת RNA. כדי לסיים, לחץ על כפתור התפריט על המזרק ולהסיר את המחט מהמחזיק.
לאחר מכן נתק את הצינור מהמזרק לפני כיבוי המזרק והמיקרומניפולטור. לאחר המיקרו-ג'ינג'י, החזירו את התאים לאנקובטור פחמן דו-חמצני ולאנקובטה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS בטמפרטורת החדר.
תקן את התאים במשך 20 דקות עם 4%paraformaldehyde בצינורות טוחנים 0.1 ב- pH 6.9. ואז לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS טמפרטורת החדר. אם מנתחים רק לוקליזציה של snRNA, שטפו בקצרה את התאים במים והרו במדיום הרכבה באמצעות DAPI.
במקרה של לוקליזציה נוספת של חלבונים, יש לחלחל לתאים עם 0.5% טריטון X-100 ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף את התאים שלוש פעמים באמצעות PBS ולהכתים אותם בנוגדנים הראשוניים והמשניים המתאימים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם PBS ולשטוף פעם אחת במים.
לאחר מכן, תן את התאים במדיום הרכבה עם DAPI. כאשר אתם מוכנים לתמונה, השתמשו במערכת מיקרוסקופית פלואורסצנטית יוקרתית המצוידת במטרה טבילה כדי לרכוש את התמונות. לאחר זיהוי התאים microinjected, לאסוף ערימה של 20 מקטעי Z עם 200 ננומטר Z צעדים לכל מדגם בכפוף deconvolution מתמטי.
לכימות אות הפלואורסצנט, פתחו תחילה את תמונת המיקרוסקופיה ב-ImageJ ופצלו ערוצים לחלונות. סנכרן חלונות לפי כלי הסינכרון של החלון. לאחר מכן, לצייר את האזור של עניין סביב גוף Cajal מזוהה על ידי כשל חיסוני coilin.
למדוד את עוצמת אות snRNA בהדרת ההשקעה המוגדרת על ידי קולין. לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות snRNA בהדרה חוזרת (ROI) הממוקמת באופן אקראי בגרעין. שמור ערכים נמדדים וחשב את היחס של אות RNA בגוף Cajal ונוקליופלזמה.
במחקר זה, snRNAs שכותרתו פלואורסצנטי הם microinjected על מנת לפקח על התחבורה שלהם בתוך התא. כדי לבדוק אם אתר SM חשוב עבור הצטברות הגוף Cajal, snRNA חסר אתר SM הוא microinjected ישירות לתוך הגרעין. הזרקה לתוך הציטופלסמה משמשת כפקד בעוד snRNA באורך מלא הוא microinjected לשמש שליטה חיובית.
לאחר הדגירה, תאים microinjected קבועים ואת קולין סמן הגוף Cajal הוא דמיין על ידי שפעת חיסונית עקיפה. snRNA באורך מלא הצטבר בגופי Cajal לאחר זריקות גרעיניות וציטופלסמיות. לעומת זאת, snRNA חסר אתר SM נשאר ציטופלסמה לאחר microinjection לתוך תא זה בעוד microinjection הגרעיני של snRNA ללא אתר SM מגלה כי רצף קשירה SM חשוב לוקליזציה הגוף Cajal כמו snRNA זה נשאר בגרעין אבל לא מצטבר בגופי Cajal.
לפעמים microinjection לתוך תא סלולרי אחד בלבד נכשל מרומה Dextran 70 קילודלטון ניתן למצוא הן בגרעין ואת הציטופלסמה. תאים אלה נמחקים מניתוח נוסף. למרות העובדה כי snRNAs שכותרתו פלואורסצנטי מאוחסנים שלילי 80 מעלות צלזיוס לפני הזריקה, השפלה RNA יכול להתרחש.
snRNA מושפל מוזרק לתוך הציטופלסמה אינו מועבר לתוך הגרעין ונשאר מקומי בציטופלסמה. snRNA כזה צריך להיות מושלך snRNA חדש צריך להיות מסונתז. חשוב להתאים כראוי הזרקה ולחצים מפצה עבור סוג התא שלך.
וכך נאמר קודם, הגדרת הגבול התחתון הנכון להזרקת תאים היא חיונית עבור microinjection טוב. זכור כי פנול-כלורופורם המשמש במהלך בידוד RNA הוא מסוכן, כי מחט microinjection הוא אובייקט חד. היזהר בעת טיפול בחומרים אלה.
