Aqui aplicamos microinjeção de RNAs fluorescentes para detectar sequências de RNA que são essenciais para a localização de RNAs nucleares curtas em estruturas nucleares chamadas corpos de Cajal. Esta técnica tem duas grandes vantagens. Primeiro, pode ser aplicado para RNAs curtas que são de outra forma difíceis de rotular e rastrear.
E segundo, permite a triagem rápida de diferentes sequências e testes de seu papel na localização do RNA. Um dia antes da microinjeção, a semente HeLa ou outras células aderentes em coberturas de 12 milímetros para atingir 50% de confluência no momento da microinjeção. Para começar, coloque um coverlip preparado no centro de uma placa de Petri, adicione células e dois milímetros de mídia cultural.
No dia seguinte, coloque a placa de Petri preenchida em um palco de microscópio. Usando um microcarregador, carregue três microlitadores da mistura de snRNA na agulha e instale a agulha no suporte do microinjetor em um ângulo de 45 graus em relação à superfície da placa de Petri. Use um objetivo de longa distância de 10X para encontrar a agulha.
Primeiro, coloque a velocidade grosseira no injetor e baixe a agulha até que toque o meio de cultura. Usando os binóculos do microscópio, encontre o ponto brilhante que é o lugar onde a agulha toca o meio da cultura. Mude a velocidade para multar e baixar ainda mais a agulha enquanto olha para o microscópio até que a ponta da agulha seja observada.
Mova a agulha no meio do campo visual e mude para um objetivo de longa distância de 40X. Depois disso, selecione a célula e mova a agulha acima da célula. Defina a pressão e o tempo para o contato celular.
Mova a agulha para baixo na célula e, em seguida, definir o limite inferior do micromanipulador. Definir o limite inferior é a parte mais crítica do protocolo. Como a superfície do deslizamento não é perfeita e como cada célula é diferente, você terá que definir o limite inferior várias vezes durante a sessão de injeção.
Em seguida, mova a agulha para trás acima da célula e pressione o botão de injeção no joystick do injetor. A agulha se moverá automaticamente dentro da célula para o local onde o limite é definido para injetar a mistura de RNA. Para finalizar, pressione o botão do menu no injetor e remova a agulha do suporte.
Em seguida, desconecte o tubo do injetor antes de desligar o injetor e o micromanípulo. Após a microinjeção, devolva as células a uma incubadora de dióxido de carbono e incubar a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, enxágue as células três vezes com PBS à temperatura ambiente.
Fixar as células por 20 minutos com 4% de paraformaldeído em tubos molares de 0,1 em pH 6.9. Em seguida, lave as células três vezes com PBS de temperatura ambiente. Se apenas a localização do snRNA for analisada, enxágue brevemente as células na água e monte em um meio de montagem com DAPI.
Em caso de localização adicional da proteína, permeabilize as células com 0,5% Triton X-100 em PBS por cinco minutos em temperatura ambiente. Enxágüe as células três vezes com PBS e manche-as com os anticorpos primários e secundários apropriados, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, enxágue três vezes com PBS e enxágue uma vez na água.
Depois disso, monte as células em um meio de montagem com DAPI. Quando estiver pronto para a imagem, use um sistema microscópico de fluorescência high-end equipado com um objetivo de imersão para adquirir as imagens. Uma vez identificadas as células microinjetadas, colete uma pilha de seções de 20 Z com 200 passos de nanômetros Z por amostra e sujeito a desconvolução matemática.
Para quantificar o sinal fluorescente, primeiro abra a imagem de microscopia no ImageJ e divida os canais em janelas. Sincronizar janelas pela ferramenta de janela sincronizar. Em seguida, desenhe a região de interesse em torno de um corpo de Cajal identificado por imunossuagem de coilina.
Meça a intensidade do sinal de snRNA no ROI definido pela coilina. Determine a intensidade da fluorescência de snRNA no ROI colocada aleatoriamente no nucleoplasma. Economize valores medidos e calcule a razão de sinal de RNA no corpo de Cajal e nucleoplasma.
Neste estudo, snRNAs fluorescentes são microinjetadas para monitorar seu transporte dentro da célula. Para testar se o local do SM é importante para o acúmulo de corpo de Cajal, o snRNA que não tem o local de SM é microinjetado diretamente no núcleo. A injeção no citoplasma serve como controle enquanto o snRNA de comprimento total é microinjetado para servir como um controle positivo.
Após a incubação, as células microinjetadas são fixadas e a coilina do marcador corporal de Cajal é visualizada por imunofluorescência indireta. O snRNA de comprimento completo acumulado em corpos de Cajal após injeções nucleares e citoplasmáticas. Em contraste, o snRNA sem o local de SM permaneceu no citoplasma após a microinjeção neste compartimento, enquanto a microinjeção nuclear de snRNA sem o local SM revela que a sequência de ligação SM é importante para a localização do corpo de Cajal, pois este snRNA permanece no núcleo, mas não se acumula em corpos de Cajal.
Às vezes, a microinjeção em apenas um compartimento celular falha e o Dextran 70 kilodalton pode ser encontrado tanto no núcleo quanto no citoplasma. Essas células são descartadas de análises posteriores. Apesar do fato de que os snRNAs fluorescentes rotulados são armazenados a 80 graus Celsius negativos antes da injeção, a degradação do RNA pode ocorrer.
O snRNA degradado injetado no citoplasma não é transportado para o núcleo e permanece localizado no citoplasma. Tal snRNA deve ser descartado e novo snRNA deve ser sintetizado. É importante ajustar corretamente a injeção e compensar as pressões para o tipo de célula.
E como dito antes, definir o limite inferior correto para injeção celular é essencial para uma boa microinjeção. Lembre-se que o fenol-clorofórmio usado durante o isolamento do RNA é perigoso e que a agulha de microinjeção é um objeto afiado. Tenha cuidado ao manusear esses materiais.
