Здесь мы применили микроинъекцию флуоресцентно помеченных РНК для обнаружения РНК-последовательностей, которые необходимы для локализации коротких ядерных РНК в ядерные структуры, называемые телами Cajal. Этот метод имеет два основных преимущества. Во-первых, он может быть применен для коротких РНК, которые в противном случае трудно маркировать и отслеживать.
А во-вторых, это позволяет быстро скрининг различных последовательностей и тестирование их роли в локализации РНК. За день до микроинъекции семя HeLa или другие адепт-клетки на 12-миллиметровых крышках достигают 50% стечения во время микроинъекции. Для начала поместите подготовленную крышку в центр чашки Петри, добавьте клетки и два миллиметра культурных средств массовой информации.
На следующий день поместите ячейку заполненной чашкой Петри на микроскоп. Используя микрозагрузчик, загрузите три микролитера смеси snRNA в иглу и установите иглу в держатель микроинжектора под углом 45 градусов по отношению к поверхности чашки Петри. Используйте 10X междугородной цели, чтобы найти иглу.
Во-первых, установите скорость грубой на инжектор и опустите иглу, пока она не коснется среды культуры. Используя бинокль микроскопа, найдите яркое пятно, которое является местом, где игла касается среды культуры. Измените скорость до штрафа и еще ниже иглы, глядя в микроскоп, пока кончик иглы наблюдается.
Перемести иглу в середину поля зрения и переключитесь на цель дальнего расстояния 40X. После этого выберите ячейку и перемести иглу над клеткой. Установите давление и время для контакта с ячейкой.
Перемести иглу в клетку, а затем установите нижний предел микроманипулятора. Установка нижнего предела является наиболее важной частью протокола. Потому что поверхность крышки не совершенна и потому что каждая клетка друг, вы установить более низкий предел несколько времен во время встречи впрыски.
Затем перемести иглу обратно над клеткой и нажмите кнопку впрыска на джойстик инжектора. Игла будет двигаться автоматически внутри клетки к месту, где установлен предел для введения РНК смеси. Чтобы закончить, нажмите кнопку меню на инжектор и удалить иглу из держателя.
Затем отключите трубку от инжектора перед выключением инжектора и микроманипулятора. После микроинъекции верните клетки в инкубатор двуокиси углерода и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. Затем, промыть клетки три раза с PBS при комнатной температуре.
Исправить клетки в течение 20 минут с 4%paraformaldehyde в 0,1 молярных труб при рН 6,9. Затем мыть клетки три раза с комнатной температурой PBS. Если анализируется только локализация snRNA, кратко промыть клетки в воде и смонтировать в монтажной среде с DAPI.
В случае дополнительной локализации белка, пронизывают клетки с 0,5%Triton X-100 в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. Промыть клетки три раза с PBS и пятно их с соответствующими первичными и вторичными антителами, как указано в текстовом протоколе. Затем промыть три раза с PBS и промыть один раз в воде.
После этого смонтировать ячейки в монтажной среде с DAPI. Когда вы будете готовы к изображению, используйте высококачественную микроскопическую систему флуоресценции, оснащенную целью погружения для получения изображений. После того, как микроинъекционные клетки будут идентифицированы, соберите стопку из 20 секций с 200 нанометров на один образец и подвергнитеся математической деконволюции.
Для количественной оценки флуоресцентного сигнала сначала откройте изображение микроскопии в ImageJ и разделите каналы на окна. Синхронизация окон инструментом синхронизации окон. Далее, привлечь области интереса вокруг тела Cajal определены катушки иммуностимулятора.
Измерьте интенсивность сигнала snRNA в катушке-определенной рентабельности инвестиций. Определите интенсивность флуоресценции snRNA в roi случайным образом помещены в нуклеоплазме. Сохранить измеренные значения и рассчитать соотношение РНК-сигнала в теле Cajal и нуклеоплазме.
В этом исследовании, флуоресцентно помечены snRNAs микроинъектируют для того, чтобы контролировать их транспортировку внутри клетки. Чтобы проверить, является ли сайт SM имеет важное значение для накопления тела Cajal, snRNA не хватает SM сайт микроинъектирован непосредственно в ядро. Инъекция в цитоплазму служит в качестве контроля в то время как полная длина snRNA микроинъектирован в качестве положительного контроля.
После инкубации, микроинъекции клетки фиксируются и Cajal тела маркер катушкин визуализируется косвенным иммунофторесценции. Полная длина snRNA накапливается в телах Cajal после ядерных и цитоплазмических инъекций. В отличие от этого, snRNA не хватает SM сайт остался в цитоплазме после микроинъекции в этом отсеке в то время как ядерная микроинъекция snRNA без сайта SM показывает, что последовательность связывания SM имеет важное значение для локализации тела Cajal, как это snRNA остается в ядре, но не накапливается в cajal органов.
Иногда микроинъекции в только один клеточный отсек не удается и обманули Dextran 70 килодальтон можно найти как в ядре и цитоплазмы. Эти клетки отбрасываются из дальнейшего анализа. Несмотря на то, что флуоресцентно помеченные snRNAs хранятся при отрицательном 80 градусов по Цельсию до инъекции, деградация РНК может произойти.
Деградированные snRNA вводят в цитоплазму не транспортируется в ядро и остается локализованным в цитоплазме. Такие snRNA должны быть отброшены и новые snRNA должны быть синтезированы. Важно правильно настроить инъекцию и компенсировать давление для вашего типа клеток.
И, как уже говорили ранее, установление правильного нижнего предела для инъекций клеток имеет важное значение для хорошего микроинъекции. Пожалуйста, помните, что фенол-хлороформ, используемый во время изоляции РНК, опасен и что микроинъекция иглы является острым объектом. Будьте осторожны при обработке этих материалов.
