Hier haben wir Mikroinjektionen von fluoreszierend markierten RNAs eingesetzt, um RNA-Sequenzen zu detektieren, die für die Lokalisierung von kurzen nuklearen RNAs in nukleare Strukturen, cajal-Körper genannt, unerlässlich sind. Diese Technik hat zwei große Vorteile. Erstens kann es für kurze RNAs angewendet werden, die sonst schwer zu beschriften und zu verfolgen sind.
Und zweitens ermöglicht es ein schnelles Screening verschiedener Sequenzen und das Testen ihrer Rolle bei der RNA-Lokalisierung. Einen Tag vor der Mikroinjektion, Samen HeLa oder andere haftende Zellen auf 12 Millimeter Abdeckungen, um 50% Konfluenz zum Zeitpunkt der Mikroinjektion zu erreichen. Legen Sie zunächst einen vorbereiteten Deckel in die Mitte einer Petrischale, fügen Sie Zellen und zwei Millimeter Kulturmedien hinzu.
Am nächsten Tag die zellgefüllte Petrischale auf eine Mikroskopbühne legen. Mit einem Mikrolader drei Mikroliter der snRNA-Mischung in die Nadel laden und die Nadel in einem Winkel von 45 Grad in bezug auf die Oberfläche der Petrischale in den Halter des Mikroinjektors einbauen. Verwenden Sie ein 10-faches Fernziel, um die Nadel zu finden.
Stellen Sie zunächst die Geschwindigkeit grob auf dem Injektor ein und senken Sie die Nadel, bis sie das Kulturmedium berührt. Finden Sie mit dem Mikroskop-Fernglas den hellen Fleck, an dem die Nadel das Kulturmedium berührt. Ändern Sie die Geschwindigkeit zu fein und weiter senken Sie die Nadel, während Sie in das Mikroskop schauen, bis die Spitze der Nadel beobachtet wird.
Bewegen Sie die Nadel in der Mitte des Gesichtsfeldes und wechseln Sie zu einem 40-fachen Langstreckenobjektiv. Danach wählen Sie die Zelle aus und bewegen Sie die Nadel über die Zelle. Stellen Sie den Druck und die Zeit für den Zellkontakt ein.
Bewegen Sie die Nadel nach unten in die Zelle und setzen Sie dann die untere Grenze des Mikromanipulators. Das Festlegen der unteren Grenze ist der kritischste Teil des Protokolls. Da die Deckbedeckungsoberfläche nicht perfekt ist und jede Zelle anders ist, müssen Sie die untere Grenze während der Injektionssitzung mehrmals festlegen.
Als nächstes bewegen Sie die Nadel wieder über die Zelle und drücken Sie die Injektionstaste auf dem Joystick des Injektors. Die Nadel bewegt sich automatisch innerhalb der Zelle an die Stelle, an der die Grenze festgelegt ist, um das RNA-Gemisch zu injizieren. Zum Abschluss drücken Sie die Menütaste am Injektor und entfernen Sie die Nadel aus dem Halter.
Trennen Sie dann das Rohr vom Injektor, bevor Sie den Injektor und den Mikromanipulator ausschalten. Nach der Mikroinjektion die Zellen in einen Kohlendioxid-Inkubator zurückbringen und bei 37 Grad Celsius für eine Stunde brüten. Als nächstes spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS bei Raumtemperatur ab.
Fixieren Sie die Zellen für 20 Minuten mit 4%Paraformaldehyd in 0,1 Molarenrohren bei pH 6,9. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit Raumtemperatur PBS. Wenn nur die snRNA-Lokalisierung analysiert wird, spülen Sie die Zellen kurz in Wasser aus und montieren Sie sie in einem Montagemedium mit DAPI.
Im Falle einer zusätzlichen Proteinlokalisierung, permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,5%Triton X-100 in PBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS und färben Sie sie mit den entsprechenden primären und sekundären Antikörpern, wie im Textprotokoll beschrieben. Dann dreimal mit PBS abspülen und einmal in Wasser abspülen.
Montieren Sie die Zellen anschließend in einem Montagemedium mit DAPI. Wenn Sie bildbereit sind, verwenden Sie ein high-End Fluoreszenzmikroskopisch-System mit einem Tauchobjektiv, um die Bilder zu erfassen. Sobald die mikroinjizierten Zellen identifiziert sind, sammeln Sie einen Stapel von 20 Z Abschnitten mit 200 Nanometer Z Schritten pro Probe und unterliegen mathematischer Dekonvolution.
Um das fluoreszierende Signal zu quantifizieren, öffnen Sie zuerst das Mikroskopiebild in ImageJ und teilen Sie Kanäle in Fenster auf. Synchronisieren Sie Fenster mit dem Werkzeug "Synchronisieren des Fensters". Als nächstes zeichnen Sie die Region des Interesses um einen Cajal-Körper, der durch Coilin-Immunostaining identifiziert wird.
Messen Sie die Intensität des snRNA-Signals im coilindefinierten ROI. Bestimmen Sie die Intensität der snRNA-Fluoreszenz im ROI, die zufällig im Nukleoplasma platziert wird. Speichern Sie Messwerte und berechnen Sie das Verhältnis des RNA-Signals im Cajal-Körper und Nukleoplasma.
In dieser Studie werden fluoreszierend markierte snRNAs mikroinjiziert, um ihren Transport innerhalb der Zelle zu überwachen. Um zu testen, ob die SM-Site für die Akkumulation des Cajal-Körpers wichtig ist, wird snRNA, der die SM-Site fehlt, direkt in den Kern mikroinjiziert. Die Injektion in das Zytoplasma dient als Kontrolle, während snRNA in voller Länge mikroinjiziert wird, um als positive Kontrolle zu dienen.
Nach der Inkubation werden mikroinjizierte Zellen fixiert und das Cajal-Körpermarker-Spulen durch indirekte Immunfluoreszenz visualisiert. Die volle SnRNA in Cajal Körpern nach nuklearen und zytoplasmatischen Injektionen angesammelt. Im Gegensatz dazu blieb snRNA ohne sM-Site nach der Mikroinjektion in dieses Fach im Zytoplasma, während die kerntechnische Mikroinjektion von snRNA ohne die SM-Site zeigt, dass die SM-Bindungssequenz für die Lokalisierung des Cajal-Körpers wichtig ist, da diese snRNA im Kern verbleibt, sich aber nicht in Cajal-Körpern ansammelt.
Manchmal scheitert die Mikroinjektion in nur ein Zellfach und ausgetrickste Dextran 70 Kilodalton findet sich sowohl im Kern als auch im Zytoplasma. Diese Zellen werden aus der weiteren Analyse verworfen. Trotz der Tatsache, dass die fluoreszierend markierten snRNAs vor der Injektion bei negativen 80 Grad Celsius gespeichert werden, kann es zu einem RNA-Abbau kommen.
Degradierte snRNA, die in das Zytoplasma injiziert wird, wird nicht in den Zellkern transportiert und bleibt im Zytoplasma lokalisiert. Solche snRNA sollte verworfen und neue snRNA synthetisiert werden. Es ist wichtig, die Injektions- und Ausgleichsdrücke für Ihren Zelltyp richtig einzustellen.
Und wie bereits gesagt, ist die Einstellung der richtigen Untergrenze für die Zellinjektion für eine gute Mikroinjektion unerlässlich. Bitte beachten Sie, dass das bei der RNA-Isolation verwendete Phenol-Chloroform gefährlich ist und dass die Mikroinjektionsnadel ein scharfes Objekt ist. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit diesen Materialien.
