שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על התפקיד הישיר של טאו בתא הגרעיני תוך אי הכללת כל זיהום טאו ציטופלסמי פוטנציאלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ישימה באופן נרחב למחקר על הפונקציה הגרעינית של טאו בסוגי תאים אחרים ובתנאים תאיים שונים. הדגמת ההליך תהיה ג'אקומו סיאנו, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.
התחל על ידי ציפוי ארבע פעמים 10 לחמשת תאי קו תא נוירובלסטומה אנושי SH-SY5Y להיות מתחלף עם וקטור הבקרה הריק, ארבע פעמים 10 עד חמשת התאים שיש לשנות עם טאו לא מתויג, ארבע פעמים 10 עד חמשת התאים להיות מומרים עם טאו-NLS, וארבע פעמים 10 עד חמשת התאים להיות מומרים עם טאו-NES לתוך בארות בודדות של צלחת שש בארות. יום לאחר ציפוי, בנפרד דגירה 400 ננוגרם של DNA ואת הנפח המתאים של שומנים cationic לתוך צינור אחד של 250 microliters של סרום מופחת לתוך באר. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, לשלב כל וקטור עם נפח אחד של שומנים קטוריים דגירה קומפלקסים שומנים DNA במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
בסוף הדגירה, להחליף את supernatants בכל באר עם שני מיליליטר של בינוני תרבות שלמה טריים ולהחליף כל היטב עם פתרון תוסף השומנים DNA המתאים עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, החלף את העל-טבעיים במדיום ההתבוללה הטרי. לניתוח כתם מערבי, לשטוף את התאים מפוספסים ומובחנים בכל באר עם PBS ולהדקר את התאים עם 500 microliters של 0.1% טריפסין לגם במשך ארבע דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
כאשר התאים התנתקו, לעצור את התגובה עם נפח שווה של מדיום שלם ולהעביר את ההשעיה התא מכל באר לתוך צינורות בודדים עבור צנטריפוגה. לאחר הסרת בזהירות את supernatants, resuspend כדורי במיליליטר אחד של PBS לצינור עבור צנטריפוגה שנייה ולהסיר את supernatants שוב. עבור תמציות חלבון הכולל, דגירה כדורי במשך 30 דקות על הקרח ב 50 כדי 100 microliters של חיץ תזה בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז.
בסוף הדגירה, צנטריפוגה התמצית ב 16, 000 פעמים גרם במשך 15 דקות לכמת את ריכוז החלבון על ידי כל מקדם כימות סטנדרטי. לאחר מכן מערבבים 20 מיקרוגרם של כל דגימת חלבון עם חמישה מיקרוליטרים של חיץ לאמלי 4X לנפח כולל של 20 מיקרוליטר ומרתיחים את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. עבור שברים תת-תאיים, חלק מחדש את התאים במדיום מלא לספירה וסובב כלפי מטה פי 10 עד ששת התאים לדגימה.
כדי לבודד את השבר הציטוסולי, הדגירה את כדורי ב 100 microliters של חיץ מיצוי ציטופלסמי קר כקרח בתוספת מעכבי פרוטאז בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין במשך 10 דקות. בסוף הדגירה, לאסוף את הדגימות על ידי צנטריפוגה ולהעביר את supernatants לתוך צינורות טרום מקורר. הוסף 100 microliters של חיץ מיצוי קרום קר קרח בתוספת מעכבי פרוטאז גלולה עבור דגירה 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין.
ואז צנטריפוגה כדורי במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ו 3, 000 פעמים g ולאסוף את supernatants לתוך צינורות חדשים. כדי לאסוף את השבר הגרעיני המסיס, להוסיף 50 microliters של מאגר החילוץ הגרעיני בתוספת מעכבי פרוטאז לכדורים עם מערבולת לפני הדגירה את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בסוף הדגירה, צנטריפוגה הדגימות ולאסוף את supernatants.
כדי לאסוף את השבר הגרעיני הבלתי מסיס, להוסיף 50 microliters של חיץ מיצוי גרעיני בתוספת מעכבי פרוטאז, סידן כלורי ונוקלאז מיקרוסקופלי לכדורים עם מערבולת. הדגירה את הדגימות במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני מערבולת וצנטריפוגה. אז תאסוף את העל-טבעיים.
כדי לאסוף את שבר cytoskeletal, להוסיף 50 microliters של מאגר מיצוי cytoskeletal בתוספת מעכבי פרוטאז לכדורים עם מערבולת. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה הדגימות ולאסוף את supernatants. לניתוח SDS-PAGE, הוסיפו שבעה מיקרוליטרים של חיץ לאמלי 4X ל-20 מיקרוליטרים של כל אחת מדגימות השבר התת-תאי שנאספו והרתיחו את הדגימות ב-100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
בסוף הדגירה, לטעון את הדגימות על ג'ל אקרילאמיד ולבצע את האלקטרופורזה במתח קבוע של 120 וולט. לאחר מכן מעבירים את החלבונים לממברנה ניטרוסלולוס ב 250 מיליאמפר במשך 90 דקות. הדגירה את הממברנה במשך חמש דקות בתספור הכתמים Ponceau כדי לבדוק אלקטרופורזה ג'ל חלבון נכונה סופג מוצלח.
בסוף הדגירה, שוטפים את הממברנה במים מזוקקים עד שהרקע נקי ומסירים את הכתם עם כביסה רציפה עם מלוחים עם טריס-buffered בתוספת Tween 20 במשך 10 דקות על שייקר. לאחר מכן, הדגירה את הממברנה עם פתרון חסימה במשך שעה בטמפרטורת החדר עם רעידות לפני כביסה שלוש פעמים עם מלוחים טריס-buffered בתוספת Tween 20 במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, להכליא את הממברנה עם הנוגדן העיקרי של עניין בחסימת פתרון לילה בארבע מעלות צלזיוס ואחריו שלוש שטיפות עם מלוחים טריס-buffered בתוספת Tween 20 במשך חמש דקות.
לאחר הכביסה האחרונה, לכליא את הממברנה עם פרוקסידס חזרת מתאים מצומד נוגדן משני בתמיסת חסימה במשך שעה בטמפרטורת החדר לפני שטיפת הממברנה עם מלוחים טריס-buffered בתוספת Tween 20 שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לזהות את רצועת החלבון באמצעות chemiluminescence לכמת את העוצמה של להקות כתם מערבי על ידי ImageJ. בהיעדר חומצה רטינואית וגורם נוירוטרופי המופק על ידי המוח, תאי SH-SY5Y מוצהרים מניחים מורפולוגיה מעוגל יותר ויוצרים גושי תאים.
כצפוי, לאחר חמישה ימים של טיפול בחומצה רטינואית, הגושים נרגעים והתאים מתפשטים. לאחר שלושה ימים נוספים של טיפול עם גורם נוירוטרופי במוח, התאים מופיעים מופצים באופן אחיד ומחוברים באמצעות רשת של neurites מסועפים. לאחר טרנספינציה טאו-NLS או טאו-NES, לוקליזציה תת-תאית טאו יכול להיות מזוהה על ידי immunofluorescence עם נוגדנים נגד טאו.
בהתאם ליעילות של ההתמזגות, התאים מציגים מיזוג כתמים גרעיני חזק עם אות DAPI לאחר ההמרה טאו-NLS או כתם ציטופלסמי עם הגרעינים הריקים לאחר טאו-NES. ניתוח כתם מערבי חושף את העשרת actin בתוך שבר cytoskeletal, tubulin בתוך שברים ציטופלסמי ציטוסקלטלי, ו H2B בתוך שברים גרעיניים. ניתוח כתם מערבי גם מאשר את הביטוי של טאו מתויג ולא מתויג בתוך התא הגרעיני ו טרנספורטר גלוטמט כלי דם ביטוי אחד בתמצית הכוללת.
ואכן, היחס בין טאו לשברים הגרעיניים והציטופלסמיים המסיסים מדגיש את העובדה כי טאו-NLS מועשר מאוד בשבר הגרעיני המסיס בעוד טאו-NES מצטמצם. יתר על כן, טאו-NLS מועשר בשבר הכרומטין הקשור ביחס לשבר הציטופלסמי בעוד טאו-NES הוא ירד. הקפד לבדוק בזהירות את מספר התאים המשמשים לשבר של כל מדגם ולאמת את העשרת הגנים משק הבית בשברים הנכונים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לבודד תאים סלולריים ולהעריך את התפקיד הפונקציונלי של טאו בגרעין.
