אחד המנגנונים המוצעים לפיו נוגדנים טיפוליים נגד טאו מפחיתים את הפתולוגיה במחלת האלצהיימר הוא ספיגה בסיווג של טאו לשעבר מצטבר פתולוגי על ידי microglia. כאן, אנו מציגים את ההערכה בסיס התא כדי להעריך את ספיגת טאו על ידי microglia. חקירה זו מייצגת כלי חקירה שימושי כדי לאפיין טוב יותר את מנגנון הפעולה של נוגדנים נגד טאו.
ביום הראשון של הניסוי, להכין את התאים BV-2 על ידי שטיפת אותם תחילה עם 1x PBS בבקבוק שבו הם כבר מתורבתים. ואז דגירה אותם עם 05% טריפסין EDTA ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% C02 עד שהם מתנתקים מן הבקבוק. להשעות מחדש את התאים במדיום תרבות על ידי צינור למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים.
לספור תאים ולהכין השעיית תא עם ריכוז סופי של 100, 000 תאים למיליליטר בינוני תרבות המכיל 200 מיקרוגרם לכל הפרין מיליליטר. הוסף 250 microliters של ההשעיה תא זה ל הבאר ב 96 גם רקמת רקמה צלחת תחתונה שטוחה. הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% C02, לילה.
לאחר הפשרת צבירות צבע-טאו pH שהוכנו בעבר על קרח, לדלל אותם 65 microliters לכל מצב של מדיום ללא סרום, כדי להפוך את פתרון 500 nanomolar. לדלל נוגדנים ב 65 microliters של מדיום ללא סרום כדי להשיג כפול הריכוז הרצוי. מערבבים צבירות צבע-טאו pH ונוגדנים בצלחת 96 גם U-התחתון.
לאטום את צלחת דילול זה דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. ביום שלמחר להסיר את המדיום מצלחת 96 באר עם תאים BV-2. לשטוף את התאים בכל באר עם 100 microliters של טמפרטורת החדר 1x PBS.
הסר PBS מצלחת התא BV-2. השתמש פיפטה רב ערוצית להעביר 125 microliters של קומפלקסים אמינו מצלחת הדילול לכל באר של 96 גם צלחת תא BV-2, ו דגירה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. לאחר הדגירה להסיר את קומפלקסים אמינו מן התאים לשטוף את התאים בכל באר עם 100 microliters של טמפרטורת החדר 1x PBS.
לאחר הסרת PBS 1x להוסיף 50 microliters של 25% טריפסין EDTA ודגירה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של מדיום culturing מחדש להשעות את באר על ידי צינור למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים. מעבירים את התאים לצלחת U-bottom 96 היטב וצנטריפוגה אותו ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
מניחים את הצלחת על קרח, ומסירים את המדיום. מוסיפים 150 מיקרוליטרים של קרח קר 1x PBS וצנטריפוגה שוב ב 400 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מניחים את הצלחת על קרח ולשטוף שוב על ידי הסרת PBS 1x הוסיף בעבר והוספת 150 microliters של קרח קר PBS לגם.
צנטריפוגה שוב באותם תנאים. מניחים את הצלחת על קרח ולשטוף את התאים על ידי הסרת PBS שנוספו בעבר והוספת 150 מאגר FACS microliters ל הבאר. צנטריפוגה שוב ב 400 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
מניחים את הלוח על הקרח ולהסיר את מאגר FACS שנוסף בעבר מחדש להשעות את התאים ב 200 מאגר FACS microliters לכל באר. מיד להמשיך לנתח על ידי FACS לרכוש 20, 000 אירועים בשער התא החי. לניתוח FACS השתמש באזור הפיזור קדימה או באזור פיזור FSCA לעומת צד או בעלילת צפיפות SSCA לשער בתאים חיים על-ידי אי-הכללת אירועים עם רמות פיזור קדמיות נמוכות יותר, כגון פסולת ותאים מתים.
לאחר מכן, בתוך אוכלוסיית התאים החיים, השתמש בגובה פיזור FSCA לעומת גובה פיזור קדימה או FSCH כדי ליצור שער יחיד ולא לכלול כפילויות וצבירה של תאים. לאחר מכן השתמש באירועים בשער singlet כדי ליצור היסטוגרמה של פרמטר יחיד לצבוע pH. השתמש בהיסטוגרמה שנוצרה כדי לקבוע תחילה את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת.
לאחר מכן לקבוע אחוז של תאים חיוביים pH לצבוע-טאו על ידי אי הכללת תאים שליליים כפי שנקבע באמצעות הפקד היחיד של BV-2. נוגדנים CBTau-28.1 לקדם ספיגה של טאו בתאי BV-2 באופן תלוי מינון כפי שמוצג על ידי ציטומטריה זרימה. הנוגדן בעל הזיקה הגבוהה הכפולה CBTau-28.1 תיווך את ספיגת טאו בתאי BV-2 במידה גבוהה יותר מהנוגדן מסוג הבר.
שברי CBTau-28.1 Fab לא להגדיל את ספיגת טאו הבסיסית המציין מנגנון הפנמה מתווך קולטן FC. מיקרוסקופ קונפוקל אישר נוגדן מתווך עלייה של ספיגת טאו. צבע pH ירוק שכותרתו אגרגטים טאו לעתים קרובות במשותף עם lysotracker צבע אדום מוכתם אורגנים חומציים ובכך מציע נוכחות של אגרגטים טאו בתא אנדוליזומלי.
שברי CBTau-28.1 Fab לא להגדיל את ספיגת טאו שוב המציין כי ספיגת אכן היה FC מתווך. ההתראה שתיארנו זה הרגע מאפשרת לנו לכמת באופן עקבי באופן עקבי את ספיגת הנוגדנים של טאו על ידי מיקרוגליה. נתונים שנוצרו עם בדיקה זו יכולים לעזור להבהר את מנגנון הפעולה של נוגדנים אנטי טאו ובכך מייצג כלי שימושי כדי לקדם נוגדנים אנטי טאו לשלב נוסף בפיתוח שלהם כטיפול פוטנציאלי לספירה.
