הקמת מודל העכבר האנושי הזה יכולה לסייע במחקרים פרה-קליניים לחקר HIV. לדוגמה, ניתן להעריך הן זנים ויראליים שונים והן התערבויות חדשניות ב- HIV. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש כדי להעריך את מצב וריאנט CCR5 תורם תאי גזע ביעילות להדביק עכברים אנושיים עם HIV ולכמת עומסים נגיפיים פלזמה העכבר.
פרוטוקול כימות RNA יכול להיות מותאם בקלות לכמת כל רצף RNA ויראלי של בחירה כי הוא מזוהה בדגימות פלזמה. לבדיקה גנטית של דגימות דם טבור עבור CCR5 דלתא 32 גרסאות, דגירה 1.25 microliters של זרימה לא גלולה עם 11.25 microliters של תערובת PCR המכיל 200 תערובת dNTP micromolar, 0.01 יחידה לכל microliter של פולימראז DNA נאמנות גבוהה, ו קדימה והפוך פריימרים כמפורט בטבלה. כוונן את עוצמת הקול במים נטולי גרעין לכ- 12.5 מיקרוליטרים עבור כל תגובת PCR והעצים את הקטעים הגנומיים באמצעות תוכנית הרכיבה PCR כפי שמצוין בטבלה.
בסוף התגובה, להפריד את מוצרי PCR על ג'ל 2%agarose. מוצרי PCR מן אללים סוג פראי הדלתא 32 אללים להניב שברי PCR של 196 זוגות בסיס 164 זוגות בסיס בהתאמה, מה שהופך את הרצועות להבחין בקלות על ידי אלקטרופורזה ג'ל. לחשיפה תוך-וגינית ל-HIV, מניחים מנורת חימום המתמקדת במרכז סביבת העבודה בה ימוקם העכבר וממוקמים טיפים סטריליים של 20 פיפיות מיקרוליטר בפיגט מתאים למכסה המנוע.
מניחים מיכל עם חומר חיטוי נוזלי לתוך מכסה המנוע לשינות מיידית של כל החומרים והנוזלים כי היו במגע עם הנגיף. מניחים את העכבר הרדמה על כרית כחולה סטרילית בתמונת supine מתחת למנורה עם הזנב של העכבר מול החלק האחורי של מכסה המנוע ולאשר את חוסר התגובה רפלקס הדוושה בעכבר. תפוס את החיה בבסיס הזנב.
בעדינות להרים את העכבר על ידי בסיס הזנב, לתמוך החיה במצב זקוף הפוך. השתמש קצה צינור סטרילי כדי לעורר את אזור איברי המין עם ליפת עדין כלפי פי הטבעת כדי לגרום ריקון של פי הטבעת כדי להקל על הלחץ על הנרתיק. כדי לחשוף את פתח הנרתיק, בזהירות לעטוף את זנב העכבר על פני האצבעות, כך הפות נפתח באופן טבעי.
בעזרת קצה פיפטה חדש, מניחים את הקצה ברמת פתח הנרתיק ומשחררים באופן אטרומי 20 מיקרוליטרים של הנגיף לתוך הנרתיק, ומאפשרים לכוח המשיכה למשוך את ההשעיה הנגיפית לתוך הנרתיק. כאשר כל הנגיף נמסר, לשמור על העכבר במצב זה במשך חמש דקות, כדי למנוע דליפה הנגרמת על ידי כוח הכבידה של הנגיף. לאחר מכן, בזהירות להחזיר את העכבר לכלוב הבית שלה במצב supine ולפקח עד החלמה מלאה.
כדי לבודד RNA מדגימות פלזמה של עכבר מופשר, השתמש בערכת בידוד RNA של וירוסים בהתאם להוראות היצרן. הוסף את הדגימה שנקשרת לעמודה והוסף שלב טיפול DNase בעמודה כדי להבטיח הסרה של כל ה- DNA בתוך דגימת הפלזמה. לאחר מכן לאחסן את דגימות RNA ב 80 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת.
כדי לסנתז cDNA, להשתמש תעתיק הפוך על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, כולל 0.5 microliters של מעכב RNase בתוך תגובת cDNA, ולאחר מכן לבצע סינתזה cDNA כמפורט בטבלה ולאחסן את דגימות cDNA ב 80 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת. כדי להכין דגימות עבור ddPCR, לערבב 11 microliters של תערובת תגובת בדיקה ddPCR המכיל פולימראז ו dNTPs עם 250 ננומולר של בדיקה מחייבת חריץ קטין ו 900 nanomolar של כל פריימרים קדימה ואחורי, כפי שצוין בטבלה. הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של כל דגימת cDNA והתאימו את סך נפחי ה-PCR ל-22 מיקרוליטרים עם מים נטולי גרעין.
השתמש שמן ייצור טיפה עבור בדיקות על גנרטור טיפה על פי פרוטוקול היצרן כדי לחקות את התערובות PCR. לאחר מכן הפעל את תוכנית PCR כמפורט בטבלה. לטיפול cART לאחר זיהום HIV מאושר, להאכיל את העכברים עם כדורי שהוכן על ידי ספק חיצוני המכיל משטר cART סטנדרטי, כפי שצוין בטבלה.
השתמש בדיאטת cART בצבע אדום כדי להבדיל אותה בקלות מאוס עכבר רגיל ולהשתמש בדיאטת אוכל בקרה ללא cART בצבע חום סטנדרטי. לצורך התחלת הטיפול, מניחים את דיאטת האוכל המכילה cART בכלובים סטריליים לפני העברת העכברים מהכלוב הישן לכלוב החדש. לאחר מכן נטר את משקולות העכברים ובדוק את צריכת האוכל המכיל cART מדי יום כדי להבטיח שהעכברים מסתגלים לשינוי.
כאן, אסטרטגיית גת cytometry זרימה לניתוח של טוהר תאי הגזע מתואר, עם הטוהר של תאי גזע חיוביים CD34 מבודדים בדרך כלל נע בין 85 ל 95%עם פחות מ 1%T זיהום תאים. ניתוח PCR מדגים את מצב גרסאות CCR5 של תאי הגזע המטוהרים של התורמים, מה שהופך את CCR5 דלתא 32 תורמים הטרוזיגים לזיהוי בקלות. תדירות הגנוטיפ המוטנטי בקבוצה של 19 תורמים הייתה סביב 15.8% בהסכמה עם מחקרים אפידמיולוגיים גדולים יותר של אוכלוסיות סקנדינביות.
שלושה עד חמישה חודשים לאחר ההעברה המאמצת של 7.5 פעמים 10 לתאים החיוביים CD45 האנושיים הרביעיים לעכברים נמען, 20 עד 50% של תאי הדם הלבנים התאוששו דגימות דם היקפיות של בעלי חיים הנמען הם תאים חיוביים CD45 אנושי העכברים פיתחו תאים אנושיים B ו- T. 64% מהעכברים נדבקים ב- HIV בעקבות חשיפה לנרתיק כפי שהוכח. ארבעה שבועות לאחר המעבר לת דיאטה של 40 יום המכילה cART סטנדרטי, העומסים הנגיפיים בעכברים נשאי HIV יורדים מתחת לגבול הזיהוי.
לאחר הפסקת הדיאטה, הנגיף מתאושש, משקף נתונים קליניים. חשוב לציין, עכברים על cART לסבול את השינוי בתזונה היטב. חשוב לזכור כי בעלי חיים אלה הם immunodeficient ולכן פגיעים לסביבה.
דבקות בטכניקות אספטיות תגדיל את הבריאות הכללית של בעלי החיים ואת הצלחת הפרוטוקול. לאחר הקמת קבוצת העכברים האנושית לזיהום HIV, הפרוטוקול עשוי להיות מותאם לכמות RNA ויראלי ברקמות או לבדיקת התערבויות חדשניות זנים ויראליים שונים. הגמישות והנגישות של עכברים אנושיים למחקרי הידבקות ב- HIV אפשרו התקדמות קריטית בווירולוגיה של HIV, באימונולוגיה ובחקר הטיפול.
לפני שתנסה פרוטוקולים הקשורים ל- HIV זיהומיות, הקפד לקבל אישור מפקידי סביבת עבודה מקומיים ולדבוק בהליכי טיהור מאושרים.
