이 인간화된 마우스 모형을 설치하는 것은 전임상 HIV 연구 결과에 도움이 될 수 있습니다. 예를 들면, 다른 바이러스성 긴장 및 새로운 HIV 내정간섭 둘 다 평가될 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 줄기 세포 기증자 CCR5 변이체 상태를 평가하고 HIV로 인간화된 마우스를 효율적으로 감염시키고 마우스 플라즈마 바이러스 부하를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
RNA 정량화 프로토콜은 플라즈마 샘플에서 검출가능한 임의의 바이러스 RNA 시퀀스를 정량화하기 위해 쉽게 적응될 수 있다. CCR5 델타 32 변이체에 대한 코드 혈액 샘플의 유전자 검사를 위해, 200 마이크로 몰러 dNTP 믹스를 포함하는 PCR 믹스의 11.25 마이크로 리터와 비 펠렛 유량의 1.25 마이크로 리터를 배양, 높은 충실도 DNA 폴리머라제의 마이크로 리터 당 0.01 단위, 및 전방 및 역 프라이머. 각 PCR 반응에 대해 핵이 없는 물로 부피를 약 12.5 마이크로리터로 조정하고 테이블에 표시된 PCR 사이클링 프로그램으로 게놈 조각을 증폭시한다.
반응의 끝에서, 2 %아가 로즈 젤에 PCR 제품을 분리. 야생형 알레일과 델타 32 알렐의 PCR 제품은 각각 196개의 베이스 페어와 164개의 베이스 쌍의 PCR 조각을 생성하여 젤 전기포고증으로 밴드를 쉽게 구별할 수 있게 합니다. 질 내 HIV 노출의 경우, 마우스가 있는 작업 공간의 중심에 초점을 맞춘 가열 램프를 놓고 멸균 20 마이크로리터 파이펫 팁을 후드에 적절한 파이펫에 넣습니다.
바이러스와 접촉한 모든 재료와 액체의 즉각적인 비활성화를 위해 액체 소독제를 가진 용기를 후드에 넣습니다. 마취된 마우스를 후드 의 뒷면을 향한 마우스의 꼬리와 램프 아래에 멸균 된 파란색 패드에 놓고 마우스의 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인합니다. 꼬리 의 바닥에 동물을 잡아.
꼬리 베이스로 마우스를 부드럽게 들어 올리고, 거꾸로 업라이트 위치에서 동물을 지원합니다. 멸균 파이프 팁을 사용하여 항문쪽으로 부드럽게 쓰다듬어 생식기 부위를 자극하여 직장의 비우기를 유도하고 질에 대한 압력을 완화하십시오. 질 개구부를 노출하려면 외음부가 자연스럽게 열리는 등 마우스 꼬리를 손가락에 조심스럽게 감쌉니다.
새로운 파이펫 팁을 사용하여, 질 개구부의 수준에 팁을 놓고 외상으로 질로 바이러스의 20 마이크로 리터를 방출하여 중력이 바이러스 현탁액을 질로 끌어 들입니다. 모든 바이러스가 전달되면 중력 유발 바이러스의 누출을 피하기 위해 5 분 동안이 위치에 마우스를 유지하십시오. 그런 다음 마우스를 supine 위치에 있는 홈 케이지로 조심스럽게 반환하고 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다.
해동 된 마우스 플라즈마 샘플에서 RNA를 분리하려면 제조업체의 지침에 따라 바이러스 RNA 격리 키트를 사용합니다. 컬럼에 결합하는 샘플을 추가하고 플라즈마 샘플 내의 모든 DNA를 제거하기 위해 열 에 DNase 치료 단계를 추가합니다. 그런 다음 RNA 샘플을 섭씨 80도에서 적어도 한 시간 동안 보관하십시오.
cDNA를 합성하기 위해, RNA 분해를 피하기 위해 cDNA 반응 내의 RNase 억제제의 0.5 마이크로리터를 포함하여 표준 프로토콜에 따라 역전사를 사용하여 테이블에 자세히 설명된 대로 cDNA 합성을 수행하고 CDNA 샘플을 섭씨 80도에서 적어도 1시간 동안 저장한다. ddPCR용 시료를 준비하기 위해, 표에 표시된 대로 폴리머라제 및 dNTP를 함유한 ddPCR 프로브 반응 혼합물 11마이크로리터와 250나노몰러의 소소홈 결합 프로브및 900 나노몰러를 혼합한다. 각 cDNA 샘플의 마이크로리터 3개를 추가하고 총 PCR 볼륨을 뉴클레아제 없는 물로 22마이크로리터로 조정합니다.
제조업체의 프로토콜에 따라 액적 발생기의 프로브에 액적 생성 오일을 사용하여 PCR 믹스를 유화합니다. 그런 다음 테이블에 설명된 대로 PCR 프로그램을 실행합니다. 확인된 HIV 감염 후 cART 치료를 위해, 표에 표시된 바와 같이 표준 cART 식이요법을 포함하는 외부 공급 업체에 의해 제조된 펠릿으로 마우스를 공급한다.
붉은 색의 cART 다이어트를 사용하여 일반 마우스 차우와 쉽게 구별하고 표준 갈색 으로 cART없이 제어 차우 다이어트를 사용합니다. 치료를 시작하기 위해, cART 함유 차우 다이어트를 멸균 케이지에 넣고 이전 케이지에서 새 케이지로 마우스를 옮기도록 한다. 그런 다음 마우스의 무게를 모니터링하고 마우스가 변화에 적응하고 있는지 확인하기 위해 매일 cART 함유 차우의 소비를 확인합니다.
여기서, 줄기 세포 순도의 분석을 위한 유동 세포측정 게이팅 전략이 묘사되고, 고립된 CD34 양성 줄기세포의 순도는 전형적으로 1% 미만의 세포 오염으로 85~95%에 이르는 것으로 나타났다. PCR 분석은 CCR5 델타 32 이종 구스 기증자를 쉽게 식별할 수 있도록 정제 된 기증자 줄기 세포의 CCR5 변이체 상태를 보여줍니다. 19명의 기증자의 단에 있는 돌연변이 유전자형의 주파수는 스칸디나비아 인구의 더 큰 역학 연구 결과와 합의에 있는 약 15.8%이었습니다.
4번째 인간 CD45 양성세포를 수혜자 마우스로 7.5배 10배, 수령인 동물 말초 혈액 샘플로부터 회수된 백혈구의 20~50%가 인간 CD45 양성 세포이며 마우스는 인간 B 및 T 세포를 개발하게 된다. 마우스의 64%는 입증된 바와 같이 질 노출 다음 HIV에 감염됩니다. 표준 cART를 포함하는 40 일 규정식으로 전환한 후에 4 주, HIV 양성 마우스에 있는 바이러스성 적하는 검출 한계 의 밑에 감소합니다.
식이 요법의 중단 후, 바이러스는 임상 데이터를 미러링, 반등. 중요한 것은, cART에 마우스는 규정식에 있는 변경을 잘 용납합니다. 이 동물은 면역 결핍이고 그러므로 환경에 취약하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
무균 기술을 준수하면 전반적인 동물 건강과 프로토콜의 성공이 증가합니다. HIV 감염을 위한 인간화된 마우스 코호트의 설치 후에, 프로토콜은 조직에 있는 바이러스성 RNA 정량화또는 다른 바이러스성 긴장에 있는 새로운 내정간섭을 시험하기 위하여 적응될 수 있습니다. HIV 감염 연구를 위한 인간화된 마우스의 유연성 그리고 접근성은 HIV 바이러스학, 면역학 및 처리 연구에서 중요한 진전을 가능하게 했습니다.
전염성 HIV와 관련된 프로토콜을 시도하기 전에 현지 작업 환경 관리의 승인을 얻고 승인 된 오염 제거 절차를 준수해야합니다.
