Создание этой гуманизированной модели мыши может помочь в доклинических исследованиях в области ВИЧ. Например, можно оценить как различные вирусные штаммы, так и новые мероприятия по борьбе с ВИЧ. Эти протоколы могут быть использованы для оценки статуса донора стволовых клеток CCR5 и для эффективного заражения гуманизированных мышей ВИЧ и количественной оценки вирусных нагрузок плазмы мыши.
Протокол количественной оценки РНК может быть легко адаптирован для количественной оценки любой вирусной РНК последовательность выбора, которая обнаруживается в образцах плазмы. Для генетического скрининга образцов пуповинной крови для CCR5 дельта 32 вариантов, инкубировать 1,25 микролитров не-pelleted потоковых с 11,25 микролитров смеси ПЦР, содержащей 200 микромолящих DNTP смеси, 0,01 единицы на микролитр высокой точности полимеразы ДНК, и вперед и обратно праймеры, как подробно описано в таблице. Отрегулируйте объем с помощью нуклеазной воды примерно до 12,5 микролитров для каждой реакции ПЦР и усиливайте геномные фрагменты с помощью программы ПЦР, указанной в таблице.
В конце реакции отделяем продукты ПЦР на 2%agarose гель. Продукты ПЦР из аллелей дикого типа и аллелей дельты 32 дают фрагменты ПЦР 196 базовых пар и 164 базовых пар соответственно, что делает полосы легко различимыми по электрофорезу геля. Для интравагинального воздействия ВИЧ поместите нагревательную лампу, ориентированную на центр рабочего пространства, где будет расположена мышь, и поместите стерильные 20 микролитровых пипеток в соответствующую пипетку в капот.
Поместите контейнер с жидким дезинфицирующим средством в капот для немедленной инактивации любых материалов и жидкостей, которые были в контакте с вирусом. Поместите анестезированную мышь на стерильную синюю площадку в положении на спине под лампой с хвостом мыши, обращенной к задней части капота, и подтвердите отсутствие реакции на педаль рефлекса в мыши. Возьмите животное у основания хвоста.
Аккуратно подняв мышь у хвостовой базы, поддержите животное в вертикальном положении вверх ногами. Используйте стерильный кончик трубы, чтобы стимулировать область половых органов с нежным поглаживать к анусу, чтобы вызвать опорожниние прямой кишки и облегчить давление на влагалище. Чтобы разоблачить вагинальное отверстие, осторожно оберните хвост мыши через пальцы, так что вульвы естественно открывается.
Используя новый наконечник пипетки, поместите наконечник на уровне вагинального отверстия и атрауматически отпустите 20 микролитров вируса во влагалище, позволяя гравитации тянуть вирусную суспензию во влагалище. Когда весь вирус был доставлен, сохранить мышь в этом положении в течение пяти минут, чтобы избежать гравитации индуцированной утечки вируса. Затем осторожно верните мышь в свою домашнюю клетку в положении на спине и следите до полного выздоровления.
Чтобы изолировать РНК от размороженных образцов плазмы мыши, используйте набор изоляции РНК вируса в соответствии с инструкциями производителя. Добавьте образец, который связывается с колонкой, и добавьте шаг лечения DNase на колонке, чтобы обеспечить удаление всей ДНК в образце плазмы. Затем храните образцы РНК при 80 градусах по Цельсию, по крайней мере один час.
Для синтеза cDNA используйте обратную транскриптазу в соответствии со стандартными протоколами, включая 0,5 микролитров ингибитора RNase в реакции cDNA, чтобы избежать деградации РНК, затем выполните синтез кДНК, как описано в таблице, и храните образцы cDNA при 80 градусах Цельсия в течение по крайней мере одного часа. Для подготовки образцов для ddPCR смешайте 11 микролитров реакционной смеси зонда ddPCR, содержащей полимеразу и дНТП, с 250 наномолярными маломерными пазами и 900 наномолярами каждой из форвардных и обратных грунтовок, как указано в таблице. Добавьте три микролитров каждого образца кДНК и отрегулируйте общие объемы ПЦР до 22 микролитров с безнуклеазной водой.
Используйте масло для производства капель для зондов на генераторе капель в соответствии с протоколом производителя для эмульгировать смеси ПЦР. Затем запустите программу PCR, изложенную в таблице. Для лечения АРТ после подтвержденной ВИЧ-инфекции кормите мышей гранулами, приготовленными внешним поставщиком, содержащим стандартный режим cART, как указано в таблице.
Используйте красный цвет cART диеты, чтобы легко отличить его от обычной мыши чау и использовать контроль чау-диеты без cART в стандартном коричневом цвете. Для начала лечения поместите диету чау, содержащую АРТ, в стерильные клетки перед переводом мышей из старой клетки в новую клетку. Затем контролировать веса мышей и проверить потребление cART-содержащих чау ежедневно, чтобы убедиться, что мыши приспосабливаются к изменению.
Здесь показана стратегия цитометрии потока для анализа чистоты стволовых клеток, при этом чистота изолированных положительных стволовых клеток CD34 обычно колеблется от 85 до 95% при загрязнении клеток менее 1%Т. Анализ ПЦР демонстрирует статус очищенного донорского ствола CCR5, что делает CCR5 delta 32 гетерозиготными донорами легко идентифицировать. Частота генотипа мутантов в группе из 19 доноров составила около 15,8% по сравнению с более крупными эпидемиологическими исследованиями скандинавского населения.
Через три-пять месяцев после принятия передачи 7,5 раз 10 на 4-й человек CD45 положительных клеток в получателя мышей, от 20 до 50% белых кровяных клеток, восстановленных из реципиента животных периферических образцов крови человека CD45 положительные клетки и мыши будут разработаны человека B и Т-клеток. 64% мышей заражаются ВИЧ после вагинального воздействия, как попродемонстрировано. Через четыре недели после перехода на 40-дневную диету, содержащую стандартный АРТ, вирусные нагрузки у ВИЧ-позитивных мышей снижаются ниже предела обнаружения.
После прекращения диеты вирус восстанавливается, отражая клинические данные. Важно отметить, что мыши на CART терпеть изменения в диете хорошо. Важно помнить, что эти животные являются иммунодефицитными и поэтому уязвимы для окружающей среды.
Придерживаясь асептических методов увеличит общее здоровье животных и протокол успеха. После создания гуманизированной когорты мышей для ВИЧ-инфекции, протокол может быть адаптирован для вирусной РНК количественной оценки в тканях или для тестирования новых вмешательств в различных вирусных штаммов. Гибкость и доступность гуманизированных мышей для исследований в области ВИЧ-инфекции позволили добиться критического прогресса в области вирусологии, иммунологии и лечения ВИЧ.
Прежде чем пытаться составление протоколов, связанных с инфекционным ВИЧ, обязательно получите одобрение местных должностных лиц по вопросам охраны окружающей среды и придерживаться утвержденных процедур обеззараживания.
