このヒト化マウスモデルを確立することは、前臨床HIV研究に役立ちます.例えば、異なるウイルス株および新規HIV介入の両方を評価することができる。これらのプロトコルは、幹細胞ドナーCCR5変異体の状態を評価し、HIVでヒト化マウスに効率的に感染させ、マウスの血漿ウイルス負荷を定量化するために使用することができる。
RNA定量プロトコルは、血漿サンプルで検出可能な任意のウイルスRNA配列を定量するために容易に適応することができる。CCR5デルタ32変異体の臍帯血サンプルの遺伝子スクリーニングでは、表に詳述されているように、200マイクロモルdNTPミックス、0.01単位、および表に詳述されているように、11.25マイクロモルdNTPミックスを含むPCRミックスの11.25マイクロリットルの非ペレットフロースルーのインキュベート、および前方および逆プライマー。ヌクレアーゼを含まない水で、PCR反応ごとに約12.5マイクロリットルに調整し、表に示すようにPCRサイクリングプログラムでゲノムフラグメントを増幅します。
反応の終了時に、PCR産物を2%アガロースゲルで分離します。野生型対立素およびデルタ32対立からのPCR産物は、それぞれ196塩基対と164塩基対のPCR断片を生成し、ゲル電気泳動によってバンドを容易に識別可能にする。膣内HIV暴露のために、マウスが配置されるワークスペースの中央に焦点を当てた加熱ランプを置き、適切なピペットで滅菌20マイクロリットルピペットチップをフードに入れる。
液体消毒剤を入れた容器をフードに入れ、ウイルスに接触した材料や液体を即座に不活性化させます。麻酔マウスを、マウスの尾部をフードの後ろに向けたランプの下のスピーヌ位置の無菌の青いパッドの上に置き、マウスのペダル反射に対する応答の欠如を確認します。尾の基部で動物をつかみます。
尾部の基でマウスを軽く持ち上げ、上下に上下に立ち上がる位置で動物を支えます。無菌のパイプチップを使用して、直腸の空を誘発し、膣への圧力を緩和するために、アヌスに向かって穏やかになで生殖器領域を刺激します。膣の開口部を露出させるために、慎重に外陰部が自然に開くように、指にマウスの尾を包みます。
新しいピペットチップを使用して、膣開口部のレベルで先端を置き、外傷を負ってウイルスの20マイクロリットルを膣に放出し、重力がウイルス懸濁液を膣に引き込むことを可能にする。すべてのウイルスが送達されたら、この位置にマウスを5分間保持し、重力によるウイルスの漏出を避けます。次に、マウスを慎重に、そのホームケージに、そのsupineの位置に戻し、完全な回復まで監視します。
解凍されたマウスの血漿サンプルからRNAを分離するには、製造元の指示に従ってウイルスRNA分離キットを使用します。カラムに結合するサンプルを追加し、オンカラムDNase処理ステップを追加して、血漿サンプル内のすべてのDNAを確実に除去します。その後、RNAサンプルを摂氏80度で少なくとも1時間保存します。
cDNAを合成するには、RNA分解を避けるためにcDNA反応内にRNase阻害剤の0.5マイクロリットルを含む標準的なプロトコルに従って逆転写酵素を使用し、表に詳述されているようにcDNA合成を行い、cDNAサンプルを少なくとも1時間摂氏80度で保存します。ddPCR用のサンプルを調製するには、表に示すように、ポリメラーゼとdMPを含むddPCRプローブ反応混合物の11マイクロリットルをマイナーグルーブ結合プローブの250ナノモルと、前方および逆プライマーのそれぞれの900ナノモルを混合する。各cDNAサンプルを3マイクロリットル加え、ヌクレアーゼを含まない水でPCRの総量を22マイクロリットルに調整します。
メーカーのプロトコルに従って、液滴発生器のプローブに液滴生成油を使用して、PCRミックスを乳化します。次に、表に示されているとおりに PCR プログラムを実行します。確認されたHIV感染後のcART処置については、表に示すように、標準的なcARTレジメンを含む外部ベンダーによって調製されたペレットをマウスに供給する。
赤い色のcARTダイエットを使用して、通常のマウスチャウと簡単に区別し、標準的な茶色のcARTなしでコントロールチャウダイエットを使用します。治療の開始のために、古いケージから新しいケージにマウスを移す前に、cART含有チャウダイエットを無菌ケージに入れます。次に、マウスの重みを監視し、cART含有チャウの消費量を毎日チェックして、マウスが変化に適応していることを確認します。
ここでは、幹細胞純度の分析のためのフローサイトメトリー測定法が描かれて、単離されたCD34陽性幹細胞の純度は、典型的には85〜95%の範囲で、1%T未満の細胞汚染を有する。PCR分析は、精製ドナー幹細胞のCCR5変異体の状態を示し、CCR5デルタ32ヘテロ接合ドナーを容易に識別可能にする。19人のドナーのグループにおける変異遺伝子型の頻度は、スカンジナビアの集団のより大きな疫学的研究と一致して約15.8%であった。
レシピエントマウスへの第4のヒトCD45陽性細胞への7.5倍の10倍の養子移送後3~5ヶ月後、レシピエント動物末梢血サンプルから回収された白血球の20~50%がヒトCD45陽性細胞であり、マウスはヒトBおよびT細胞を発症しているであろう。64%のマウスが、実証したように膣暴露後にHIVに感染する。標準cARTを含む40日間の食事に切り替えてから4週間後、HIV陽性マウスのウイルス負荷は検出限界を下回る。
食事の停止後、ウイルスはリバウンドし、臨床データをミラーリングする。重要なことに、cART上のマウスは食事の変化をよく容認する。これらの動物は免疫不全であり、したがって環境に対して脆弱であることを覚えておくことが重要です。
無菌技術に従うと、動物の健康とプロトコルの成功全体が向上します。HIV感染のためのヒト化マウスコホートの確立後、プロトコルは、組織におけるウイルスRNA定量または異なるウイルス株における新規介入をテストするために適応され得る。HIV感染研究のためのヒト化マウスの柔軟性とアクセシビリティは、HIVウイルス学、免疫学、および治療研究において重要な進歩を可能にしました。
感染性HIVに関するプロトコルを試みる前に、地元の職場環境職員の承認を得て、承認された除染手続きを遵守してください。
