Establecer este modelo de ratón humanizado puede ayudar en estudios de investigación preclínicos sobre el VIH. Por ejemplo, se pueden evaluar tanto diferentes cepas virales como nuevas intervenciones contra el VIH. Estos protocolos se pueden utilizar para evaluar el estado de la variante CCR5 del donante de células madre e infectar eficientemente ratones humanizados con VIH y para cuantificar las cargas virales del plasma de ratón.
El protocolo de cuantificación de ARN se puede adaptar fácilmente para cuantificar cualquier secuencia de ARN viral de elección que sea detectable en muestras de plasma. Para el cribado genético de muestras de sangre de cordón umP5 para ccR5 delta 32 variantes, incubar 1,25 microlitros de flujo no peletizador con 11,25 microlitros de mezcla de PCR que contienen 200 micromolares dNTP mezcla, 0,01 unidades por microlitro de polimerasa de ADN de alta fidelidad, y imprimaciones delanteras e inversas como se detalla en la tabla. Ajuste el volumen con agua sin nucleasas a aproximadamente 12,5 microlitros para cada reacción PCR y amplificar los fragmentos genómicos con el programa de ciclismo PCR como se indica en la tabla.
Al final de la reacción, separar los productos de PCR en un gel de 2% de agarosa. Los productos PCR de los alelos de tipo salvaje y los alelos delta 32 producen fragmentos de PCR de 196 pares base y 164 pares base respectivamente, haciendo que las bandas sean fácilmente distinguibles por electroforesis de gel. Para la exposición intravaginal al VIH, coloque una lámpara de calefacción enfocada en el centro del espacio de trabajo donde se ubicará el ratón y coloque las puntas estériles de la pipeta de 20 microlitrotros en una pipeta apropiada en el capó.
Coloque un recipiente con desinfectante líquido en la campana para la inactivación inmediata de cualquier material y líquido que haya estado en contacto con el virus. Coloque el ratón anestesiado sobre una almohadilla azul estéril en la posición supina debajo de la lámpara con la cola del ratón mirando hacia la parte posterior de la capucha y confirme la falta de respuesta al reflejo del pedal en el ratón. Agarre el animal en la base de la cola.
Levantando suavemente el ratón por la base de la cola, apoya al animal en posición vertical al revés. Usa una punta de tubo estéril para estimular el área genital con un suave acariciamiento hacia el ano para inducir el vaciado del recto y aliviar la presión sobre la vagina. Para exponer la abertura vaginal, envuelva cuidadosamente la cola del ratón a través de los dedos, de tal manera que la vulva se abra naturalmente.
Usando una nueva punta de pipeta, coloca la punta al nivel de la abertura vaginal y libera atraumáticamente 20 microlitros del virus en la vagina, permitiendo que la gravedad tire de la suspensión viral hacia la vagina. Cuando todo el virus ha sido entregado, mantenga el ratón en esta posición durante cinco minutos para evitar la fuga inducida por la gravedad del virus. Luego, devuelva cuidadosamente el ratón a su jaula de inicio en la posición supina y monitoree hasta la recuperación completa.
Para aislar el ARN de muestras de plasma de ratón descongeladas, utilice un kit de aislamiento de ARN de virus de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Agregue la muestra que se une a la columna y agregue un paso de tratamiento DNase en la columna para asegurar la eliminación de todo el ADN dentro de la muestra de plasma. A continuación, almacene las muestras de ARN a 80 grados centígrados durante al menos una hora.
Para sintetizar el ADNc, utilice la transcriptasa inversa de acuerdo con los protocolos estándar, incluidos 0,5 microlitros de un inhibidor de la ADNr dentro de la reacción del ADNr para evitar la degradación del ARN, luego realice la síntesis de ADNr como se detalla en la tabla y almacene las muestras de ADNr a 80 grados centígrados durante al menos una hora. Para preparar muestras para ddPCR, mezcle 11 microlitros de la mezcla de reacción de la sonda ddPCR que contenga polimerasa y dNNP con 250 nanomolares de sonda de unión de ranuras menores y 900 nanomolares de cada una de las imprimaciones delanteras e inversas, como se indica en la tabla. Agregue tres microlitros de cada muestra de ADNn a y ajuste los volúmenes totales de PCR a 22 microlitros con agua sin nucleasas.
Utilice aceite de generación de gotas para sondas en un generador de gotas de acuerdo con el protocolo del fabricante para emulsionar las mezclas de PCR. A continuación, ejecute el programa PCR como se describe en la tabla. Para el tratamiento con cART después de la infección confirmada por el VIH, alimente a los ratones con pellets preparados por un proveedor externo que contenga un régimen estándar de cART, como se indica en la tabla.
Usa una dieta cART de color rojo para distinguirla fácilmente de la comida ordinaria del ratón y usa una dieta de control de chow sin cART en un color marrón estándar. Para el inicio del tratamiento, coloque la dieta de comida que contiene cART en jaulas estériles antes de transferir los ratones de la jaula antigua a la nueva jaula. A continuación, monitoree los pesos de los ratones y compruebe el consumo de chow que contiene cART diariamente para asegurarse de que los ratones se están ajustando al cambio.
Aquí, se representa la estrategia de gating de citometría de flujo para el análisis de la pureza de las células madre, con la pureza de las células madre positivas CD34 aisladas que típicamente oscilan entre el 85 y el 95% con una contaminación por células T inferior al 1%. El análisis de PCR demuestra el estado de las células madre de los donantes purificados CCR5, lo que hace que los donantes heterocigotos CCR5 delta 32 sean fácilmente identificables. La frecuencia del genotipo mutante en un grupo de 19 donantes fue de alrededor del 15,8%, de acuerdo con estudios epidemiológicos más grandes de poblaciones escandinavas.
De tres a cinco meses después de la transferencia adoptiva de 7,5 veces 10 a las 4a células positivas CD45 humanas a ratones receptores, entre el 20 y el 50% de los glóbulos blancos recuperados de las muestras de sangre periférica de animales receptores son células positivas CD45 humanas y los ratones habrán desarrollado células B y T humanas. El 64% de los ratones se infectan con el VIH después de la exposición vaginal, como se ha demostrado. Cuatro semanas después de cambiar a una dieta de 40 días que contiene CART estándar, las cargas virales en ratones VIH positivos disminuyen por debajo del límite de detección.
Después del cese de la dieta, el virus rebota, reflejando los datos clínicos. Es importante destacar que los ratones con cART toleran bien el cambio en la dieta. Es crucial recordar que estos animales son inmunodeficientes y, por lo tanto, vulnerables al medio ambiente.
Adherirse a las técnicas asépticas aumentará la salud animal general y el éxito del protocolo. Después del establecimiento de la cohorte de ratones humanizados para la infección por VIH, el protocolo puede adaptarse para la cuantificación del ARN viral en los tejidos o para probar nuevas intervenciones en diferentes cepas virales. La flexibilidad y accesibilidad de los ratones humanizados para los estudios de infección por VIH han permitido un progreso crítico en la investigación en la vitología, la inmunología y el tratamiento del VIH.
Antes de intentar protocolos que involucren el VIH infeccioso, asegúrese de obtener la aprobación de los funcionarios locales del entorno de trabajo y de adherirse a los procedimientos de descontaminación aprobados.
