A criação desse modelo humanizado de camundongos pode auxiliar em estudos pré-clínicos de pesquisa sobre HIV. Por exemplo, tanto as cepas virais diferentes quanto novas intervenções de HIV podem ser avaliadas. Esses protocolos podem ser usados para avaliar o status da variante CCR5 do doador de células-tronco e para infectar eficientemente camundongos humanizados com HIV e quantificar cargas virais de plasma de camundongos.
O protocolo de quantificação de RNA pode ser facilmente adaptado para quantificar qualquer sequência de RNA viral de escolha que seja detectável em amostras de plasma. Para triagem genética de amostras de sangue do cordão umbilical para as variantes CCR5 delta 32, incubar 1,25 microlitros de fluxo não pelleted com 11,25 microlitros de mistura PCR contendo 200 mistura dNTP micromolar, 0,01 unidade por microlitro de polimerase de DNA de alta fidelidade e primers dianteiros e reversos conforme detalhado na tabela. Ajuste o volume com água livre de nuclease para aproximadamente 12,5 microliters para cada reação pcr e amplie os fragmentos genômicos com o programa de ciclismo PCR, conforme indicado na tabela.
No final da reação, separe os produtos PCR em um gel de 2% de agarose. Os produtos PCR dos alelos do tipo selvagem e dos alelos delta 32 produzem fragmentos pcr de 196 pares de base e 164 pares de base, respectivamente, tornando as bandas facilmente distinguíveis pela eletroforese de gel. Para exposição intravaginal ao HIV, coloque uma lâmpada de aquecimento focada no centro do espaço de trabalho onde o mouse estará localizado e coloque 20 pontas de pipeta microliter estéreis em uma pipeta apropriada no capô.
Coloque um recipiente com desinfetante líquido no capô para inativação imediata de quaisquer materiais e líquidos que tenham estado em contato com o vírus. Coloque o mouse anestesiado sobre uma almofada azul estéril na posição supina sob a lâmpada com a cauda do mouse de frente para a parte de trás do capô e confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal no mouse. Segure o animal na base da cauda.
Levantando suavemente o mouse pela base da cauda, apoie o animal em uma posição de cabeça para baixo ereto. Use uma ponta de tubo estéril para estimular a área genital com o acariciamento suave em direção ao ânus para induzir o esvaziamento do reto e aliviar a pressão sobre a vagina. Para expor a abertura vaginal, enrole cuidadosamente a cauda do rato através dos dedos, de tal forma que a vulva se abra naturalmente.
Usando uma nova ponta de pipeta, coloque a ponta ao nível da abertura vaginal e libere atraumaticamente 20 microliters do vírus na vagina, permitindo que a gravidade puxe a suspensão viral para dentro da vagina. Quando todo o vírus for entregue, mantenha o rato nesta posição por cinco minutos para evitar o vazamento induzido pela gravidade do vírus. Em seguida, devolva cuidadosamente o mouse para sua gaiola doméstica na posição supina e monitore até a recuperação completa.
Para isolar o RNA das amostras de plasma de camundongo descongelado, use um kit de isolamento de RNA do vírus de acordo com as instruções do fabricante. Adicione a amostra que se liga à coluna e adicione uma etapa de tratamento DNase na coluna para garantir a remoção de todo o DNA dentro da amostra de plasma. Em seguida, armazene as amostras de RNA a 80 graus Celsius por pelo menos uma hora.
Para sintetizar o CDNA, use transcriptase reversa de acordo com os protocolos padrão, incluindo 0,5 microliters de um inibidor de RNase dentro da reação cDNA para evitar a degradação do RNA, em seguida, realize a síntese de CDNA como detalhado na tabela e armazene as amostras de cDNA a 80 graus Celsius por pelo menos uma hora. Para preparar amostras para ddPCR, misture 11 microlitros da mistura de reação da sonda ddPCR contendo polimerase e dNTPs com 250 nanomolar de sonda de ligação de sulco menor e 900 nanomolar de cada um dos primers dianteiros e invertidos, conforme indicado na tabela. Adicione três microliters de cada amostra de cDNA e ajuste os volumes totais de PCR para 22 microliters com água sem nuclease.
Use óleo de geração de gotículas para sondas em um gerador de gotículas de acordo com o protocolo do fabricante para emulsionar as misturas de PCR. Em seguida, execute o programa PCR conforme descrito na tabela. Para o tratamento cART após infecção confirmada pelo HIV, alimente os camundongos com pelotas preparadas por um fornecedor externo contendo um regime padrão de cART, conforme indicado na tabela.
Use uma dieta cART de cor vermelha para diferenciá-la facilmente da comida comum do rato e use uma dieta de controle de chow sem cART em uma cor marrom padrão. Para o início do tratamento, coloque a dieta de chow contendo cART em gaiolas estéreis antes de transferir os ratos da gaiola antiga para a nova gaiola. Em seguida, monitore os pesos dos camundongos e verifique o consumo de chow contendo cART diariamente para garantir que os ratos estejam se ajustando à mudança.
Aqui, é retratada a estratégia de gating de citometria de fluxo para análise da pureza das células-tronco, com a pureza das células-tronco positivas CD34 isoladas tipicamente variando entre 85 e 95% com uma contaminação celular inferior a 1%T. A análise do PCR demonstra o status da variante CCR5 das células-tronco do doador purificado, tornando facilmente identificáveis os doadores heterozigos delta 32 da CCR5 delta 32. A frequência do genótipo mutante em um grupo de 19 doadores foi de cerca de 15,8% de acordo com estudos epidemiológicos maiores de populações escandinavas.
Três a cinco meses após a transferência adotiva de 7,5 vezes 10 para o 4º CD45 células positivas humanas em camundongos receptores, 20 a 50% dos glóbulos brancos recuperados de amostras de sangue periférico animal receptor são células positivas CD45 humanas e os camundongos terão desenvolvido células B e T humanas. 64% dos camundongos são infectados pelo HIV após a exposição vaginal, como demonstrado. Quatro semanas depois de mudar para uma dieta de 40 dias contendo cART padrão, as cargas virais em camundongos hiv positivos diminuem abaixo do limite de detecção.
Após a cessação da dieta, o vírus se recupera, espelhando dados clínicos. É importante ressaltar que os ratos no cART toleram bem a mudança na dieta. É fundamental lembrar que esses animais são imunodeficientes e, portanto, vulneráveis ao meio ambiente.
A adesão às técnicas assépticas aumentará o sucesso geral da saúde animal e do protocolo. Após o estabelecimento da coorte humanizada de camundongos para infecção pelo HIV, o protocolo pode ser adaptado para quantificação viral de RNA em tecidos ou para testar novas intervenções em diferentes cepas virais. A flexibilidade e a acessibilidade de camundongos humanizados para estudos de infecção pelo HIV permitiram progressos críticos na virologia do HIV, imunologia e pesquisa de tratamento.
Antes de tentar protocolos envolvendo HIV infeccioso, certifique-se de obter aprovação das autoridades locais do ambiente de trabalho e aderir aos procedimentos aprovados de descontaminação.
