פרוטוקול ניקוי רקמות חדשני זה משפר את הטכנולוגיה הקיימת כדי לאפשר מבט מדויק יותר ב- vivo על סוגי תאים ספציפיים בלב והתנהגותם בתנאי פציעה. פרוטוקול זה הוא מהיר ופשוט למדי. זה מאפשר שמירה על פלואורסצנטיות מארקה עם הפרעה מינימלית מן פלואורסצנטיות אוטומטית רקמת רקע ללא צורך כתם תא או רקמות.
התחל באמצעות כרית גזה ספוגה באתנול של 70% כדי לנקות את פני השטח הגחוניים של העכבר הניסיוני. השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך רוחבי של שלושה סנטימטרים, כשלושה מטרים מתחת לתהליך xiphoid ולשחרר את העכבר מהבטן לתהליך xiphoid כדי להפריד את העור מרקמת דופן הבטן הבסיסית. בצע חתך רוחבי של שני סנטימטרים ברקמת דופן הבטן התת עורית, שלושה סנטימטרים מתחת לתהליך xiphoid ולעשות חתך אנכי מן החתך הזה במעלה קו האמצע דרך כלוב הצלעות.
הצמד את כלוב הצלעות בחזרה כדי לחשוף את הלב. ולהשתמש מזרק 10 מיליליטר מצויד במחט 27 מד להזריק PBS קר לתוך קאווה vena מעולה ואבי העורקים. כאשר כל הדם כבר סמוק מהלב, לספק 10 מיליליטר של קר 4%PFA לתוך ורידים מעולה אבי העורקים כדי להתחיל את תהליך הקיבעון.
כאשר כל התיקון כבר הבזיק, בלו את הלב ולהשתמש אזמל להב ישר כדי להפריד את atria, החדר הימני מחיצה ואת החדר השמאלי. מניחים את הלב לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר של קר 4%PFA עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס על מאגוז. למחרת בבוקר, הוסיפו פתרון יוזם 0.25% לתמיסת הידרוג'לים שהוכנה זה עתה והעבירו את הלב לג'ל ההידרו.
לעטוף את הצינור חרוט בנייר כסף עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס ללא הפרעה פיזית. למחרת בבוקר לחמם את הצינור באמבטיה חרוזים 37 מעלות צלזיוס במשך 2.5 שעות לפני השימוש מלקחיים להעביר בזהירות את הלב לתוך צינור 15 מיליליטר של PBS. לשטוף את הלב שלוש פעמים PBS במשך שעה אחת לכל לשטוף ב 37 מעלות צלזיוס על מאגוז ולהעביר את הלב לתוך הסל של מכונת אלקטרופורזה פעילה.
לאבטח את המכסה במקום ולמלא את מאגר תא אלקטרופורזה פעיל עם פתרון ניקוי אלקטרופורזה. ברגע שהתא מלא, להטביע את הסל בתמיסה ולהדק את המכסה על מכונת האלקטרופורזה למקומו. לאחר מכן הפעל את מכונת האלקטרופורזה ב 1.5 אמפר ו 37 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות.
לאחר אלקטרופורזה, בדוק את הראייה של הלב כדי לוודא שלא נותרה רקמה אטומה. לשטוף את הלב פינה שלוש פעמים ב 15 מיליליטר שתיים במשך שעה אחת PBS טרי ב 37 מעלות צלזיוס לכל לשטוף על מוצף. לפני שקוע את הלב סוכן decolorizing כדי להפחית פלואורסצנטיות אוטומטי heme.
לאחר 48 שעות, לשטוף את הלב שלוש פעמים PBS כפי שהוכח ולשקול את הלב RIMS מוכן טרי במשך 48 שעות לפני ההדמיה. להדמיה תלת-ממדית של הלב הנקה, תחילה, הניחו שכבה דקה של שומן ואקום על תחתית מאגר תחתון מודפס בתלת-ממד, באותו גובה שבו נראית הדגימה. מלא את המאגר ב- RIMS והשתמש בקצה פיפטה כדי להסיר בועות.
בזהירות למקם את הלב RIMS עם הקיר החדר השמאלי פונה כלפי מעלה, דואג כי אין בועות שהוכנסו לתוך הפתרון. השתמש גריז ואקום לצרף להחליק כיסוי זכוכית על פני השטח התחתון של פיסת המאגר העליון מודפס 3D ומניחים את מכסה המאגר העליון למטה על המאגרים התחתונים, דואג למנוע בועות. ואז למלא את המאגרים העליונים עם גליצרול.
השתמש במיקרוסקופ קונפוקאלי כדי לדמות את הלבבות המנוקוים. שילוב של ניקוי רקמת לב מעודנת עם הדמיה תלת-ממדית מאפשר הדמיה מפורטת ומתקדמת של פיברובלסטים לבביים. באמצעות טכניקת הדמיה זו, fibroblasts הם נצפו להיות צפוף ארוז יש מורפולוגיה צירים בלבבות לא נפגעים.
לאחר פציעת רפרופוזיה איסכמיה, אובדן של פיברובלסטים לב נראה באזור איסכמי במשך שלושת הימים הראשונים לאחר פציעה. ביום השביעי וה-14, הפיברובלסטים היגרו או התפשטו כדי לאכלס מחדש את אזור הרקמות הפצועות. ביום ה-28, אוכלוסיית הפיברובלסטים הלבביים המקיפים את האזורים הפצועים של הלב נמצאים בצפיפות הגבוהה ביותר שלהם.
יום וחצי לאחר פציעת אוטם שריר הלב, מעט פיברובלסטים נשארים בחדר השמאלי הפצוע. ביום השלישי, לעומת זאת, הפיברובלסטים מתרחבים ונוכחים ברוב החדר השמאלי. בניגוד לניתוח איסכמי, עירוי של אנגיוטנסין 2 ופנולפרין במשך מספר שבועות אינו גורם לאובדן רקמת לב ודילול קיר.
במקום זאת, פיברובלסט ליישר לאורך הציר של דפוס התכווצות סליל ימני כפי שניתן לראות בעת שימוש מעודן פרוטוקול ניקוי רקמות. בנוסף, לאחר טיפול אנגיוטנסין 2 ו phenolefrin, fibroblasts מופיעים קטנים מעוגלים בניגוד לצורת ציר שנצפו במודלים של תפוצת איסכמיה ופציעה אוטם שריר הלב. הסליקה האלקטרופורטית צריכה להתבצע בזהירות במיוחד כאשר עובדים עם לבבות שעברו פרוטוקולי פציעה.
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך כיצד פיברובלסטים לב מגיבים לפציעה ב vivo. סמני פלואורסצנט שונים יכולים לשמש גם כדי להבין כיצד הלב מגיב לפציעה ברמה התאית.
