פרוטוקול זה מראה כיצד הרכבנו ואפיינו את השכבה לפי שכבה JBNm ברמה המולקולרית. JBNm עוטף את TGF-B1, ומונע את שחרורו ברקמה הסובבת, ובכך מקדם כונדרוגנזה מקומית. היווצרות ה- JBNm מתוקננת, ומאפשרת ליצור JBNms שונים עבור יישומים עתידיים.
מבנה השכבה הייחודי מאפשר עטיפת גורם גדילה, יצירת שחרור מקומי קבוע, המונע היפרטרופיה, ומקיים צמיחה. JBNm מספקת מיקרו-סביבה הומאוסטטית להתחדשות רקמת סחוס, בתוך מקום סגור, בשל יכולת ההזרקה שלה, אשר יכולה לשמש לתרחישים שונים, כמו שברים או חללים בצורה לא סדירה. כדי להתחיל, להוסיף שמונה מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר TGF-B1, תלוי במים ל 32 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר Matrilin-3 תלוי במים.
פיפטה כדי להבטיח ערבוב נכון של חלבונים אלה. הוסף 80 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר. ננו-צינוריות בסיס יאנוס, או JBNts תלויות במים, לתמיסת TGF-B1, Matrilin-3.
פיפטה שוב ושוב כדי להבטיח מיזוג נכון. עבור קבוצת JBNt, הוסף חמישה מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר, JBNts ל-50 מיקרוליטר מים כדי ליצור תמיסה של 90.9 מיקרוגרם למיליליטר. עבור קבוצת Matrilin-3, הוסף 40 מיקרוליטרים של 10 מיקרוגרם למיליליטר מטרילין-3 עד 15 מיקרוליטר מים, כדי ליצור תמיסה של 7.3 מיקרוגרם למיליליטר.
עבור קבוצת TGF-B1, הוסף 10 מיקרוליטרים של 10 מיקרוגרם למיליליטר, של TGF-B1 ל-45 מיקרוליטר מים, כדי ליצור תמיסה של 1.8 מיקרוגרם למיליליטר. עבור קבוצת הננו-מטריקס של בסיס יאנוס או JBNm, הוסף 40 מיקרוליטרים של 10 מיקרוגרם למיליליטר, מטרילין-3 עד 10 מיקרוליטרים של 10 מיקרוגרם למיליליטר TGF-B1. התסיסו כדי להבטיח ערבוב נכון.
לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר JBNts לתמיסה, שוב ושוב pipetting לערבב את הדגימה. באמצעות ספקטרופוטומטר, מדוד את ספקטרום הקליטה של כל קבוצה. תייג את ה-TGF-B1 באמצעות ערכה לסימון חלבונים, בהתאם להוראות היצרן.
הוסף 20 מיקרוליטר של 20 מיקרוגרם למיליליטר, המסומנים TGF-B1, ל -25 מיקרוליטר מים, כדי ליצור תמיסת בדיקה של 8.9 מיקרוגרם למיליליטר. תייג את Matrilin-3 באמצעות ערכת תיוג נפרדת. הוסף 20 מיקרוליטרים של 80 מיקרוגרם למיליליטר המסומנים Matrilin-3 עד 25 מיקרוליטר מים, כדי ליצור פתרון בדיקה של 36 מיקרוגרם למיליליטר.
יש לערבב 20 מיקרוליטרים של 80 מיקרוגרם למיליליטר עם התווית Matrilin-3 עם 20 מיקרוליטרים של 20 מיקרוגרם למיליליטר המסומנים TGF-B1, וחמישה מיקרוליטרים של מים, והתוצאה היא TGF-B1, תרכובת Matrilin-3 המסומנת. פיפטה את התערובת מספר פעמים כדי לערבב. הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר JBNts ל-40 מיקרוליטרים של מים, והתוצאה היא תמיסה של 111 מיקרוגרם למיליליטר.
לאחר מכן הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר JBNts לתמיסת TGF-B1, Matrilin-3 המסומנת, ופיפטה שוב ושוב כדי לערבב את התרכובת. מעבירים כל קבוצת דגימה לבאר של צלחת באר 384 שחורה. טען את הצלחת לקורא מיקרו-פלטות רב-מצבי, ובצע מדידות באורכי גל עירור של 488 ו-555 ננומטר בהתאם לפרוטוקולים של היצרן.
בתנאים פיזיולוגיים, ספקטרום פוטנציאל הזטה של מטרילין-3 היה טעון שלילית בשל הנקודה האיזואלקטרית שלו. לאחר הוספת TGF-B1 למטרילין-3, פוטנציאל הזטה של תרכובת TGF-B1 Matrilin-3 גדל לערך כמעט נייטרלי. פוטנציאל הזטה של JBNm היה הגבוה ביותר מבין שלוש הקבוצות.
ספקטרום הקליטה הנראה לעין של UV אישר את היווצרות השכבה ההיררכית לפי מבנה פנימי של השכבה של ה- JBNm, הטבעות הארומטיות של שרשראות הצד של הליזין, וה- JBNts תרמו לפסגות הקליטה, ב 220 ו -280 ננומטר בהתאמה. TEM שימש לאפיון המורפולוגיה של JBNts ו- JBNm. לאחר שילוב עם חלבונים, צרורות עבים של JBNm נצפו יוצרים מבנה פיגומים.
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אישרה את נוכחות השכבה לפי מבנה שכבה, והדגימה את חתך הרוחב של JBNm. לאחר סימון הפלואורסצנט האדום Matrilin-3 עטף את צרורות JBNt, ויצר את השכבה החיצונית של JBNm, בעוד TGF-B1 הפלואורסצנטי הירוק יצר שכבה פנימית. העברת אנרגיית התהודה הפלואורסצנטית הציגה שיאי פליטה של 520 ננומטר עבור קבוצות TGF-B1 המסומנות, ו-570 ננומטר עבור קבוצות מטרילין-3.
נבדקה ההשפעה של JBNm על ההידבקות והתפשטות התאים של HMSC. ה-JBNm הראה ש-HMSCs מקובצים יחד עם עצמו, בעוד שפחות תאים דבקו ב-JBNts. יישור התאים וגודל התאים ב-JBNm הראו כי JBNts מילאו תפקיד בהידבקות התאים, בעוד שהחלבונים הגבירו את הזיקה של הידבקות תאים.
לאחר היום הראשון של תרבית התאים, קבוצות JBNm ו-TGF-B1 הראו שגשוג תאים משמעותי בהשוואה לקבוצות האחרות. כאשר משך מבנה התא הוגדל לשלושה וחמישה ימים, קבוצות JBNm ו-TGF-B1 הדגימו התפשטות תאים מוגברת עוד יותר. כאשר מתייגים באופן פלואורסצנטי את ה- JBNm, חשוב שה- TGF-B1 וה- Matrilin-3 יסומנו בנפרד ויתערבבו לפני הוספת ה- JBNts, כדי לאפשר היווצרות תקינה של השכבה לפי מבנה שכבה.
הערכה נוספת של הפיגומים יכולה לספק הבנה כיצד הם יעילים בטיפולים טיפוליים. ליתר דיוק, בדיקת התפשטות תפוקה גבוהה, יכולה לקבוע את המינון האופטימלי במבחנה, ומאוחר יותר in vivo. יצירת NanoMatriX חדשנית זו מאפשרת לחוקרים להשתמש בפיגום הזרקה המבוסס על ננו-חומר כדי לחדש את הסחוס.
גישה זו של חיקוי פולי מאפשרת אנדרוגנזה משופרת והתפשטות אתר נגדי.
