Um protocolo fornece um modelo simples para avaliar a integridade sináptica de forma dependente da idade. Assim, podemos estudar doenças neurodegenerativas em tecidos que são favoráveis tanto à análise estrutural quanto funcional. Esta técnica facilita a preservação do tecido neuronal e muscular das junções neuromusculares musculares longitudinais dorsais.
Investigar de forma abrangente a função sináptica ao longo do tempo e tecidos difíceis de trabalhar. Este método pode ser aplicado ao estudo de doenças neurodegenerativas, incluindo ELA, Parkinson, Huntington e Doença de Alzheimer. Antes de iniciar a dissecção corte aproximadamente 10 milímetros da ponta de uma pipeta de 200 microliter.
Depois de administrar a anestesia, jogue de seis a 10 moscas em uma placa de Petri de seis centímetros contendo 70% de etanol e use um pincel para beber suavemente cada mosca. Após um a dois minutos, use fórceps para transferir uma mosca pelas pernas ou asas para um prato de dissecção revestido de desintoxicação de silicone contendo sete a dez mililitros de PBS sob um microscópio dissecando. Com a mosca submersa na PBS, use o número cinco do Dumont sem cortes para remover cuidadosamente as asas e usar uma tesoura de dissecção de mola de borda reta para fazer uma pequena incisão no lado ventral da cutícula para remover as pernas.
Segurando a tesoura de dissecção em uma mão e fórceps contundentes na outra, posicione o lado ventral da mosca para cima e segurando o espécime no lugar com os fórceps, remova a cabeça e o abdômen com a tesoura. Use uma pipeta de 200 microlitrais definida para 40 microliters e a ponta de pipeta modificada para coletar as lentes e colocar as amostras de tecido isolada em um tubo devidamente rotulado contendo 900 microliters de PBS e 150 microliters de 32% de formaldeído. Após 30 minutos em temperatura ambiente, use uma pipeta Pasteur para remover o fixador e enxaguar os plies três vezes com 1,5 mililitros de PBS por lavagem.
Antes de começar as biseções Don luvas de proteção cryo e óculos de segurança e encher um frasco de passeio com nitrogênio líquido. Use um disjuntor de lâmina para pegar uma lâmina de penas em um ângulo e dobre a lâmina para quebrar um pequeno pedaço. Use o disjuntor da lâmina para travar a lâmina na posição e use uma pipeta pasteur de vidro para remover todos os PBS dos tubos de amostra.
Use pinças criogênicas para submergir os tubos no frasco de nitrogênio líquido. Após 10 segundos, use uma pipeta Pasteur para adicionar aproximadamente 300 microliters de PBS gelado a cada tubo no gelo, e coloque um lado ventral de machado pobre para cima em um prato de dissecção revestido de silicone de 10 centímetros contendo PBS gelado. Use um par maçante de fórceps para posicionar o tórax e encontrar pares de fórceps, para remover alguns dos gânglios torácicos para expor a linha média do tórax.
Usando a linha média do tórax como guia, use a peça para fazer um corte raso através de um terço do tórax e use os fórceps contundentes para posicionar o tórax em um ângulo de 45 graus. Use a lâmina para cortar em linha reta pela linha média do tórax para obter dois hemithoraces e fazer cuidadosamente um ou dois cortes para remover o excesso de tecido sem danificar os músculos longitudinais dorsais. Em seguida, coloque as amostras de tecido muscular em um tubo apropriadamente rotulado de PBS.
Quando todas as amostras de tórax tiverem sido bisseccionadas permeabilizem os tecidos no tampão de bloqueio por pelo menos uma hora a quatro graus Celsius. Ao final da incubação, o vórtice preparou uma solução de manchas estruturais recém-preparada e adiciona 150 microliters da mancha a cada amostra para uma incubação de duas horas em um rotador à temperatura ambiente no escuro. Após a coloração lave as amostras em PBST, e coloque cinco etiquetas de reforço empilhadas e cortadas ao meio 15 milímetros em um slide de microscópio de vidro.
Use uma dica de micro pipeta modificada para transferir os Thoraces para cada slide e use uma limpeza de laboratório para remover qualquer excesso de PBST. Use fórceps para organizar as amostras de tal forma que os Thoraces estão enfrentando o lado muscular para cima. Quando as amostras estiverem corretamente orientadas, use uma ponta de pipeta de 200 microliteres para aplicar 70 microliters de meio de montagem em cada slide e cobrir cada slide com um deslizamento de cobertura.
Em seguida, use esmalte para revestir generosamente as bordas externas dos deslizamentos de cobertura para obter uma vedação completa em torno de cada tecido. Para avaliar a integridade sináptica. Junções neuromusculares podem ser manchadas com peroxidase de rabanete e floe tin Neurônios motores em proteína de ligação de piche de 43 mutans Kilodalton têm pouca ou nenhuma coloração de peroxidase de rabanete até o dia 21, enquanto a proteína do tipo selvagem permanece intacta.
Não são observadas diferenças visíveis na coloração muscular. Além da coloração estrutural, a rotulagem de junção neuromuscular muscular dorsal dorsal também pode fornecer uma avaliação da integridade sináptica com marcadores pré-sinápticos e pós-sinápticos. Note que o congelamento do flash de nitrogênio líquido facilita uma biseção bem sucedida, pois o tecido congelado não flash é mais suscetível a danos durante a dissecção.
Após este procedimento, as amostras de preservação podem ser analisadas por microscopia confocal para medir aspectos específicos da estrutura sináptica.
