プロトコルは、年齢に依存する方法でシナプスの整合性を評価するための簡単なモデルを提供します。したがって、構造的および機能的な分析の両方に適した組織の神経変性疾患を研究することができます。この技術は、後方縦筋神経筋接合部からの神経細胞および筋肉組織の両方の保存を促進する。
時間の経過に伴うシナプス機能と、作業が困難な組織を包括的に調査する。この方法は、ALS、パーキンソン病、ハンチントン、アルツハイマー病などの神経変性疾患の研究に適用することができます。解剖を開始する前に、200マイクロリットルピペットの先端から約10ミリメートルをカット。
麻酔を施した後、70%エタノールを含む6センチメートルのペトリ皿で6〜10ハエを再生し、ペイントブラシを使用して各ハエを穏やかに飲み込みます。1〜2分後、鉗子を使用して、解剖顕微鏡の下で7〜10ミリリットルのPBSを含むシリコーンエラストマーコーティング解剖皿に脚または翼で1つのフライを転送します。PBSに水没したハエで、鈍いデュモン番号5は慎重に翼を取り除くために鉗子を見つけ、まっすぐなエッジスプリング解剖はさみを使用して、キューティクルの腹側に小さな切開をして脚を取り除きます。
解剖はさみを片手に、もう一方の手に鈍い鉗子を持ち、フライ腹側を上に置き、鉗子で標本を所定の位置に保持し、はさみで頭と腹部を取り除きます。40マイクロリットルに設定された200マイクロリットルのピペットと改変ピペットチップを使用して、トーレースを収集し、PBSの900マイクロリットルと32%ホルムアルデヒドの150マイクロリットルを含む適切なラベル付けチューブに単離された組織サンプルを配置します。室温で30分後、パスツールピペットを使用して固定剤を取り除き、洗浄ごとに1.5ミリリットルのPBSで3回層をすすぐ。
二項を開始する前にドンクライオ保護手袋と安全メガネと液体窒素でツアーフラスコを埋めます。ブレードブレーカを使用して羽根を斜めにつかみ、ブレードを曲げて小片を壊します。ブレードブレーカーを使用してブレードを所定の位置にロックし、ガラス製のパスツールピペットを使用してサンプルチューブからPBSをすべて取り除きます。
極低温ピンセットを使用して液体窒素のフラスコにチューブを沈めます。10秒後、パスツールピペットを使用して氷上の各チューブに約300マイクロリットルの氷冷PBSを加え、氷冷PBSを含む10センチメートルのシリコーンエラストマーコーティング解剖皿に1つの貧しいアックス腹側を上に置きます。胸郭を配置し、胸郭の正中線を露出する胸部神経節の一部を除去するために、鉗子のペアを見つけるために、鈍い鉗子のペアを使用してください。
胸郭の正中線をガイドとして使用し、劇を使用して胸郭の3分の1を浅くカットし、鈍い鉗子を使用して胸郭を45度の角度に配置します。ブレードを使用して胸郭の正中線をまっすぐに切り取って2つのヘミツレースを獲得し、1つまたは2つのカットを慎重に行い、後頭筋を損傷することなく余分な組織を取り除きます。次に、筋肉組織サンプルをPBSの適切に標識されたチューブに入れます。
すべての胸郭サンプルが摂氏4度で少なくとも1時間ブロッキングバッファー内の組織を透過性を二分した場合。インキュベーションの終わりに、渦は新たに調製した構造染色液を調製し、各サンプルに150マイクロリットルの汚れを加え、暗い室温で回転子に2時間インキュベーションします。PBSTでサンプルを洗浄した後、5つの補強ラベルを積み重ねて、1つのガラス顕微鏡スライドに半分15ミリメートル離れてカットします。
各スライドにトレースを転送し、余分なPBSTを除去するために実験室のワイプを使用するために、変更されたマイクロピペットチップを使用してください。トレースが筋肉側に向かうようサンプルを配置するために鉗子を使用してください。サンプルが正しく向いている場合は、200マイクロリットルのピペットチップを使用して、各スライドに70マイクロリットルの取り付け媒体を塗布し、各スライドをカバースリップで覆います。
その後、マニキュアを使用してカバースリップの外側の端を寛大にコーティングし、各組織の周りに完全なシールを得ます。シナプスの完全性を評価する。神経筋接合は、43キロダルトン変異体のタール結合タンパク質中の西洋ワサビペルオキシダーゼおよびフロースズ運動ニューロンで染色することができ、野生型タンパク質はそのまま残っている間、21日目までに西洋ワサビペルオキシダーゼ染色はほとんどない。
筋肉染色に目に見える違いは認められない。構造的染色背部縦筋肉神経筋接合標識に加えて、シナプス前およびシナプス後マーカーによるシナプス完全性の評価を提供することもできる。液体窒素フラッシュ凍結は、非フラッシュ凍結組織が解剖中に損傷を受けやすいため、正常な二分切除を促進することに注意してください。
この手順に従って保存サンプルを共焦点顕微鏡法で分析し、シナプス構造の特定の局面を測定することができる。
