Протокол обеспечивает простую модель оценки синаптической целостности в возрастной зависимости. Таким образом, мы можем изучать нейродегенеративные заболевания в тканях, которые подразделяются как структурным, так и функциональным анализом. Этот метод облегчает сохранение как нейронной, так и мышечной ткани от спинного продольного мышечного нервно-мышечного соединения.
Для всестороннего исследования синаптической функции с течением времени и тканей, которые трудно работать. Этот метод может быть применен к изучению нейродегенеративных заболеваний, включая ALS, Паркинсона, Хантингтона и болезни Альцгеймера. Перед началом вскрытия вырезать примерно 10 миллиметров от кончика 200 микролитров пипетки.
После введения анестезии, играть от шести до 10 мух в шесть сантиметров Петри блюдо, содержащее 70% этанола и использовать кисть краски, чтобы мягко глоток объединить каждую муху. После одной-двух минут, использовать типсы для передачи одной мухи на ноги или крылья в силиконовой еластомер покрытием рассечение блюдо, содержащее от семи до 10 миллилитров PBS под рассечением микроскопа. С мухой погружен в PBS, используйте тупой Dumont номер пять найти тибры, чтобы тщательно удалить крылья и использовать охватывают прямой край пружины вскрытия ножницы, чтобы сделать небольшой разрез в брюшной стороне кутикулы, чтобы удалить ноги.
Держа ножницы для вскрытия в одной руке и тупые миппы в другой, распойте вентралюю сторону мухи вверх и удерживая образец на месте с помощью типсов, удалите ножницами голову и живот. Используйте 200 микролитровую пипетку, установленную на 40 микролитров, и модифицированный наконечник пипетки для сбора торообразных и поместить образцы изолированных тканей в соответствующую помеченную трубку, содержащую 900 микролитров PBS и 150 микролитров 32% формальдегида. После 30 минут при комнатной температуре, используйте пастер пипетку, чтобы удалить фиксатор и промыть plies три раза с 1,5 миллилитров PBS за стирку.
Перед началом раздвоения Дон Крио защитные перчатки и защитные стаканы и заполнить тур колбу с жидким азотом. Используйте выключатель лезвия, чтобы захватить перо лезвие под углом и согнуть лезвие, чтобы разорвать небольшой кусок. Используйте выключатель лезвия, чтобы заблокировать лезвие в положении и использовать стеклянную пипетку Pasteur, чтобы удалить все PBS из пробных труб.
Используйте криогенные пинцеты, чтобы погрузить трубки в колбу жидкого азота. Через 10 секунд, используйте пастер пипетку, чтобы добавить около 300 микролитров ледяного PBS к каждой трубке на льду, и поместите один бедный топор брюшной стороны вверх в 10 сантиметров силиконовой елатомера покрытием рассечение блюдо, содержащее ледяной PBS. Используйте тупую пару типсов, чтобы распоставить грудную клетку и найти пару типсов, чтобы удалить некоторые из грудных ганглиев, чтобы разоблачить середину грудной клетки.
Используя середину грудной клетки в качестве руководства, используйте игру, чтобы сделать мелкий разрез через одну треть грудной клетки и использовать тупые типсы для позиционирования грудной клетки под углом 45 градусов. Используйте лезвие, чтобы сократить прямо вниз по средней линии грудной клетки, чтобы получить два hemithoraces и тщательно сделать один или два разреза, чтобы удалить избыток ткани, не повреждая спинной продольных мышц. Затем поместите образцы мышечной ткани в соответствующую помеченную трубку PBS.
Когда все образцы грудной клетки были разделены на две части, пронизывают ткани в блокируя буфер, по крайней мере один час при четырех градусах по Цельсию. В конце инкубации вихрь свежеприготовленный структурный раствор пятна и добавить 150 микролитров пятна в каждый образец в течение двух часов инкубации на ротатор при комнатной температуре в темноте. После окрашивания мыть образцы в PBST, и место пять этикетки подкрепления сложены и разрезать пополам 15 миллиметров друг от друга на одном стеклянном слайде микроскопа.
Используйте модифицированный микро пипетки отзыв для передачи Thoraces на каждом слайде и использовать лабораторные салфетки для удаления каких-либо избыточных PBST. Используйте типсы, чтобы организовать образцы таким образом, что Thoraces сталкиваются мышцы вверх. Когда образцы правильно ориентированы использовать 200 микролитров пипетки отзыв применять 70 микролитров монтажной среды для каждого слайда и покрыть каждый слайд с крышкой скольжения.
Затем используйте лак для ногтей, чтобы щедро покрыть внешние края крышки скользит, чтобы получить полную печать вокруг каждой ткани. Оценить синаптической целостности. Нейромышечные соединения могут быть окрашены пероксидазом хрена и Floe tin Motor нейронов в смолы связывания белка 43 Kilodalton mutans практически нет хрена пероксидазы окрашивания на день 21, в то время как белок дикого типа остается нетронутым.
Видимых различий в окрашиваниях мышц не наблюдается. В дополнение к структурной окрашивания спинной продольной мышцы нервно-мышечной маркировки соединения может также обеспечить оценку синаптической целостности с предварительной синаптической и пост синаптических маркеров. Обратите внимание, что замораживание вспышки жидкого азота облегчает успешную бисекцию, так как не flash замороженные ткани более восприимчивы к повреждениям во время вскрытия.
После этой процедуры образцы консервации могут быть проанализированы с помощью конфокальные микроскопии для измерения конкретных аспектов синаптической структуры.
