Ein Protokoll bietet ein einfaches Modell für die altersabhängige Bewertung der synaptischen Integrität. So können wir neurodegenerative Erkrankungen in Geweben untersuchen, die sowohl für strukturelle als auch für funktionelle Analysen geeignet sind. Diese Technik erleichtert die Erhaltung von neuronalen und Muskelgewebe aus den dorsalen Längsmuskel neuromuskulären Knoten.
Um die synaptische Funktion im Laufe der Zeit und Gewebe, die schwer zu arbeiten sind, umfassend zu untersuchen. Diese Methode kann auf die Untersuchung von neurodegenerativen Erkrankungen wie ALS, Parkinson, Huntington und Alzheimer angewendet werden. Vor Beginn der Sezierstelle etwa 10 Millimeter von der Spitze einer 200-Mikroliter-Pipette schneiden.
Nach der Verabreichung der Anästhesie, spielen sechs bis zehn Fliegen in einer sechs Zentimeter Petrischale mit 70% Ethanol und verwenden Sie einen Pinsel, um sanft zu schlucken verschmelzen jede Fliege. Nach ein bis zwei Minuten, verwenden Sie Zange, um eine Fliege durch die Beine oder Flügel auf eine Silikon Elastomer beschichtet Ezierschale mit sieben bis 10 Milliliter PBS unter einem Sezieren Mikroskop zu übertragen. Mit der Fliege in der PBS untergetaucht, verwenden Stumpf Dumont Nummer fünf finden Zangen, um sorgfältig die Flügel zu entfernen und verwenden Spanne eine gerade Kante Feder Sezierschere, um einen kleinen Schnitt in der ventralen Seite der Nagelhaut zu machen, um die Beine zu entfernen.
Halten Sie die Sezierschere in einer Hand und stumpfe Zange in der anderen, positionieren Sie die Fliegenventralseite nach oben und halten Sie die Probe mit der Zange an Ort und Stelle, entfernen Sie den Kopf und Bauch mit der Schere. Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette auf 40 Mikroliter und die modifizierte Pipettenspitze, um die Thoraces zu sammeln und die isolierten Gewebeproben in ein entsprechend beschriftetes Rohr mit 900 Mikroliter PBS und 150 Mikroliter 32% Formaldehyd zu legen. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur verwenden Sie eine Pasteur Pipette, um die Fixierung zu entfernen und spülen Sie die Lagen dreimal mit 1,5 Milliliter PBS pro Wäsche.
Vor Beginn der Bisections Don cryo Schutzhandschuhe und Schutzbrille und füllen Sie einen Tourkolben mit flüssigem Stickstoff. Verwenden Sie einen Klingenbrecher, um eine Federklinge in einem Winkel zu greifen und die Klinge zu biegen, um ein kleines Stück abzubrechen. Verwenden Sie den Klingenbrecher, um die Klinge in Position zu verriegeln, und verwenden Sie eine Pasteur-Pipette aus Glas, um alle PBS aus den Probenrohren zu entfernen.
Verwenden Sie kryogene Pinzette, um die Rohre in den Kolben von flüssigem Stickstoff zu untertauchen. Verwenden Sie nach 10 Sekunden eine Pasteur-Pipette, um jedem Rohr ca. 300 Mikroliter eiskalte PBS auf Eis hinzuzufügen, und legen Sie eine schlechte Axt-Ventralseite in eine 10 Zentimeter große Silikonelastomer-beschichtete Sezierschale mit eiskaltem PBS. Verwenden Sie ein stumpfes Zangenpaar, um den Thorax zu positionieren und ein Zangenpaar zu finden, um einige der Brustganglien zu entfernen, um die Mittellinie des Thorax freizulegen.
Verwenden Sie die Mittellinie des Thorax als Führung, verwenden Sie das Spiel, um einen flachen Schnitt durch ein Drittel des Thorax zu machen und verwenden Sie die stumpfe Zange, um den Thorax in einem 45-Grad-Winkel zu positionieren. Verwenden Sie die Klinge, um gerade die Mittellinie des Thorax zu schneiden, um zwei Hemithoraces zu erhalten und vorsichtig ein oder zwei Schnitte zu machen, um das überschüssige Gewebe zu entfernen, ohne die dorsale Längsmuskulatur zu beschädigen. Legen Sie dann die Muskelgewebeproben in eine entsprechend beschriftete Tube PBS.
Wenn alle Thoraxproben durchzogen wurden, durchlässig das Gewebe im Sperrpuffer für mindestens eine Stunde bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation, Wirbel frisch vorbereitet strukturelle Fleckenlösung und fügen Sie 150 Mikroliter des Flecks zu jeder Probe für eine zweistündige Inkubation auf einem Rotator bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Färbung waschen Sie die Proben in PBST, und legen Sie fünf Bewehrungsetiketten gestapelt und in halb 15 Millimeter Auseinander auf einem Glasmikroskop-Dia geschnitten.
Verwenden Sie eine modifizierte Mikropipettenspitze, um die Thoraces auf jeden Schlitten zu übertragen, und verwenden Sie ein Labortuch, um überschüssiges PBST zu entfernen. Verwenden Sie Zangen, um die Proben so zu arrangieren, dass die Thoraces auf muskelseitd nach oben gerichtet sind. Wenn die Proben richtig ausgerichtet sind, verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um 70 Mikroliter Montagemedium auf jeden Schlitten aufzutragen und jeden Schlitten mit einem Deckelschlupf zu bedecken.
Dann verwenden Sie Nagellack, um großzügig die Außenkanten der Abdeckung saugen, um eine vollständige Dichtung um jedes Gewebe zu erhalten. Um die synaptische Integrität zu bewerten. Neuromuskuläre Knoten können mit Meerrettichperoxidase und Floe-Zinn-Motor-Neuronen in Teerbindenprotein von 43 Kilodalton-Mutanen gefärbt werden, haben wenig bis gar keine Meerrettich-Peroxidase-Färbung am 21. Tag, während das Wild-Protein intakt bleibt.
Es werden keine sichtbaren Unterschiede in der Muskelfärbung beobachtet. Neben struktureller Färbung dorsale Längsmuskel neuromuskuläre Kreuzung Etikettierung kann auch eine Bewertung der synaptischen Integrität mit präsynaptischen und postsynaptischen Markern bieten. Beachten Sie, dass das Einfrieren von flüssigem Stickstoffblitz eine erfolgreiche Bisektion ermöglicht, da nicht blitzgefrorenes Gewebe während der Zerlegung anfälliger für Beschädigungen ist.
Nach diesem Verfahren können die Konservenproben durch konfokale Mikroskopie analysiert werden, um bestimmte Aspekte der synaptischen Struktur zu messen.
