פירוק רקמת השומן לתת-סוגים היה מאתגר מכיוון שהטבע השברירי של האדיפוזיטים. פרוטוקול זה פותח כדי להתגבר על זה על ידי בידוד יעיל של גרעינים בודדים. זרימת עבודה זו מספקת גרעיני יחיד מטוהרים ביותר עם אגרגטים גרעיניים ממוזערים ופסולת תאית.
זה יתרון לפרופיל תמלול חד-תאי של אלפי תאים. פרוטוקול פשוט וחזק זה ניתן ליישם כדי ללמוד ארגון ברמת הרקמות של adipocyte בתאים שלהם תושב שומן. ובמיוחד, לפיתוח פנוטיפים, נוקאאוט שומן ועכברים מהומנים.
הדגמה חזותית של פרוטוקול זה היא קריטית, כך שאנשים שאין להם ניסיון רב בטיפול adipocyte יכול לשכפל תובנה לתוך הטרוגניות שומן. לאחר איסוף רקמת שומן מעכברים, לטפוח אותו יבש עם מגבת נייר, ומניחים אותו בצלחת נקייה. מוסיפים סידן כלורי למאגר העיכול לריכוז סופי של 10 מ"מ.
לאחר מכן, להוסיף נפח קטן לרקמה ביסודיות לטחון אותו. מוסיפים כמחצית מכמות מאגר העיכול המוכן לרקמה הטחון. ולהשתמש פיפטה סרולוגית להעביר את המדגם לצינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
לשטוף את המנה עם המאגר הנותר ולהוסיף אותו צינור 50 מ"ל. פיפטה המדגם למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר מכן, הדגירה אותו במשך 12 עד 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס תוך טלטול ב 200 עד 210 סל"ד.
לאחר הדגירה, הוסף 0.5%BSA לדגימה ביחס נפח של 1 עד 1 ומערבב היטב על-ידי צינורות. צנטריפוגה המדגם ב 300 xg במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לסובב את השבר stromovascular משאיר את שבר adipocyte על גבי. סנן את השבר העליון למרות מסנן תא 400 מ 'לתוך צינור 50 מ"ל.
לאחר מכן, הפוך את המסנן במהופך מעל הצינור והעבר את האדיפוזיטים לצינור חדש באמצעות 0.5%BSA כדי לשטוף לאחור את המסנן. להביא את הנפח הכולל של BSA ל 10 עד 15 מ"ל ו pipette המדגם למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית. לאחר מכן, צנטריפוגה זה שוב ב 300 xg במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הצנטריפוגה, השתמש בקצה פיפטה רחב כדי להעביר בזהירות את השכבה העליונה של המדגם למסנן תאים של 100 מ 'על גבי צינור חדש מקורר מראש על קרח. לשטוף את המסנן עם כמות מספקת של מאגר הכנת גרעינים, ולאחר מכן להשליך אותו. מצעד זה ואילך, שמור דגימה על קרח ועבוד במהירות.
השאירו את הדגימה על קרח עד שתי דקות לסירוגין היפוך הצינור לערבב. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1000 xg ו 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את גלולה ב 1 מ"ל של מאגר הכנת גרעינים.
מעבירים את הדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי מטפל כדי למנוע נגיעה בקירות הצינור הישן. מוסיפים 0.6 יחידות למעכב RNase ומערבבים אותו. לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם במשך 10 דקות נוספות.
הסר את supernatant ו resuspend גלולה ו 1 מ"ל של מאגר שטיפת גרעינים. סנן פעמיים את הדגימה לתוך צינור נקי באמצעות מסננים לערימת 30 מ '. לאחר מכן, לשטוף את המסננים עם כ 300 L של מאגר לשטוף גרעינים.
כדי לאשר בידוד מוצלח של גרעינים בריאים, הכתם aliquot קטן של המדגם עם trypan ולהשתמש מונה תאים אוטומטיים כדי להעריך את גודל מת ממוצע ואחוז של תאים מתים. הכתם ב aliquot קטן של המדגם עם DAPI ולבחון אותו תחת מיקרוסקופ עם מטרה 20X ומעלה. הגרעינים צריכים להיות עגולים ויש להם קרום גרעיני שלם.
חצים לבנים מצביעים על גרעינים ללא קרום שלם. לאחר ניקוי הגרעינים עם FACS, לרכז מדגם זה על ידי צנטריפוגה ב 500 xg במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מחדש אותו בנפח המתאים של מאגר שטיפת גרעינים.
כדי להשיג 50 עד 1500 גרעינים לכל ריכוז L ולהמשיך עם זרע RNA גרעיני תא יחיד. כדי להסיר פסולת סלולרית וכפולים, גרעיני adipocyte ממוינים לגודל וצפיפות כדי לא לכלול אגרגטים גרעיניים multiplets. ולבסוף לאירועים חיוביים DAPI.
אסטרטגיית דירוג זו גורמת לגרעין יחיד מטוהר מאוד עם אגרגטים ופסולת מינימליים. כאשר נבדק על ידי מיקרוסקופיה, הגרעינים ממוינים צריך להיות עגול יש קרום שלם. טיהור מוצלח של הגרעינים יכול להתבצע גם עם qRT-PCR בזמן אמת באמצעות פריימרים עבור ucp1 mRNA המתהווה, גן סמן עבור adipocytes חום.
פלטפורמת הכרום קבעה תמלול של 7500 גרעינים מרמת שומן חומה בין-שרירית של מורין. שבעה סוגי תאים שונים התגלו עם הפחתת ממדי T-SNE וקיבוץ באשכולות k-פירושו. כל האשכולות ביטא Fabp4, גן adipocyte פאן קבוצת משנה ביטא רמה גבוהה של Ucp1 mRNA.
גרעיני מבודד ולאחר מכן אישר למרות פרוטוקול זה יכול להיות נתון כמעט כל פלטפורמה ביטוי גנים ברמת תא יחיד כולל כרום מ 10x Genomics.
