המחבר מודה לדאג על עידודו המתמיד והתמיכה הבלתי מעורערת שלו, כמו גם לחברי מעבדת מלטון על המשוב וההערות המועילות שלהם על כתב היד. המחבר רוצה גם להודות למשרד משאבי בעלי החיים של הרווארד (OAR) על הטיפול המסור בבעלי חיים.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם ל- IACUC (פרוטוקול #: 11-32) והנחיות AAALAC באוניברסיטת הרווארד.
1. הכנת פתרונות והתקנה להרדמה והחלמה
<ol><li>הכן תמיסת טרי 0.1% tricaine להרדמה ו 0.5% תמיסת מלח נתרן סולפראזין להתאוששות. הפוך את הפתרונות באמצעות מים מתאימים לגידול אקסולוטל37 על פי פרוטוקולי IACUC מאושרים במכון המחקר הרלוונטי (הפתרון של Holtfreter שונה, למשל). ודא כי הפתרונות מעורבים היטב וכי נפח מספיק מוכן על מנת להטביע את האקסולוטל כולו.<ol>
<li>כדי להכין 0.1% פתרון tricaine, לערבב 1 גרם של tricaine ו 1 גרם של סודיום ביקרבונט עם 1 L של מים. הפתרון ניתן לשנות את קנה המידה על פי מתכון זה.</li>
		<li>כדי להכין 0.5% תמיסת מלח נתרן סולפאמרזין, לערבב 5 גרם של מלח נתרן sulfamerazine עם 1 L של מים. הפתרון ניתן לשנות את קנה המידה על פי מתכון זה. תמיסת סולפאמרזין היא אנטי-ביוטית שתמנע זיהום חיידקי במהלך ההחלמה הכירורגית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחטא את האזור הכירורגי על ידי ריסוס אותו עם Clidox-S או 70% אתנול. לחטא כלים כירורגיים (מלקחיים, לנתח מספריים, מספריים קפיץ) על ידי autoclaving. אם אתם מבצעים ניתוחים מרובים, הקפידו לחטא את הכלים הכירורגיים בעזרת מחטא חרוזים חם בין בעלי חיים.</li>
	<li>כדי להגדיר את אזור ההתאוששות, מניחים צלחת פטרי 15 ס"מ או כל מיכל שיתאים axolotl על גבי דלי מלא קרח רטוב. ממלאים את צלחת הפטרי ברמה נמוכה של 0.5% תמיסת מלח נתרן סולפרזין, מספיק כדי שהאקסולוטל לא יהיה שקוע לחלוטין. ההתאוששות על הקרח לאחר הניתוח תאט את תנועת החיה בזמן שהיא מתעוררת מהרדמה, ומאפשרת לאזור התפור להחלים באופן יחסי ללא הפרעה. הערה: הגדרה זו יכולה להיות מותאמת אישית על ידי חוקרים בהתאם לחומרים שיש להם זמינים.</li>
</ol>2. ביצוע ההליך הכירורגי מלא דש העור
<ol><li>להרדים את האקסולוטל על ידי טבילתו במיכל של 0.1% פתרון tricaine. הנסיעה אורכת כ-15-20 דקות. ודא כי האקסולוטל אכן מורדם לחלוטין על ידי ביצוע צביטת זנב. אם אין תגובה מהאקסולוטל, המשך בניתוח. הערה: יש להשתמש באקסולוטלים ישנים וגדולים יותר לניתוח זה (בגודל של לפחות 15 ס"מ). ודא כי האקסולוטל נשאר hydrated היטב לאורך כל הניתוח על ידי הרטבת העור מעת לעת עם מי מערכת axolotl באמצעות פיפטה פלסטיק. הקפידו להכין באופן אספטי את האתר הכירורגי על ידי השקיית האזור עם PBS סטרילי לפני הניתוח. החיה צריכה גם להיות ממוקמת על וילון כירורגי סטרילי עבור ההליך.</li>
	<li>בצעו קטיעת גפיים בקצה הדיסטלי של יסודות השלד הזוגופודיאליים באמצעות המספריים המנתחים (איור 1.1).</li>
	<li>בעזרת המספריים הקפיציים, בצעו חתך קטן (כ-2 מ"מ) בחלק הגחוני של העור (איור 1.2).</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, לקלף בזהירות את העור אל קו האמצע של יסודות השלד zeugopodial, חשיפת רקמות הגפיים הבסיסיות (שריר, עצם, וכו ') (איור 1.3). הקפד לא לפגוע בעור. ראה הערה לאחר שלב 2.8.</li>
	<li>כרתו את רקמות הגפיים החשופות בקו האמצע של הזוגופוד באמצעות מספריים כירורגיות (איור 1.4).</li>
	<li>לדחוף בחזרה את רקמת השריר עם המספריים כירורגיים לקצץ את העצם החשופה. הערה: זה הכרחי כדי להבטיח ריפוי משופר וגם כדי להגדיל את ההצלחה של הניתוח כמו עצם בולטת יכול להיות משונן נגד דש נתפר ולשבש את השלמות של דש עור שלם בהמשך.</li>
	<li>בעזרת המלקחיים, משכו בזהירות את העור בעובי מלא במיוחד מעל מישור הקטיעה כדי לכסות את הרקמות הבסיסיות החשופות ולתפור במקום על ידי חיבור לעור בעובי מלא גחון (איור 1.5).</li>
	<li>תפרו את הצד הימני והשמאלי הנותרים של דש העור לתוך החלקים הגחוניים הבסיסיים של עור שלם. ניתן לעשות זאת על ידי תפירת צידי הדש באופן "מוצלב" (מומלץ) (איור 1.6.6.9), או פשוט תפירה היישר לתוך עור הגחון. השתמש במלקחיים ובמספריים קפיץ מעוקלים לתפירה. ודא כי לא ניתן לראות רקמות בסיסיות חשופות וכי התפרים קשורים בחוזקה (קשורה לפחות שלוש פעמים). הערה: חשוב שהעור השלם לא ייפגע בשלבים 2.4, 2.7-2.8. מצאנו כי נזק לעור בעובי מלא כבר בקורלציה עם ניתוחים לא מוצלחים, כמו אזורי הנזק עדיין עשויים ליצור אפידרמיס פצע קטן. במידת האפשר, נסו להשתמש בזוג מלקחיים עמומים יותר בעת מסירת דש העור בעובי מלא.</li>
	<li>בצע קטיעה על הגפה הנגדית (פיקוח פנימי אופציונלי על בעלי חיים) על ידי כריתתו ברמה באמצע zeugopod עם מספריים כירורגיים. לדחוף בחזרה את רקמת השריר עם מספריים כירורגיים לקצץ את העצם החשופה. הערה: ניתן לעשות בקרת גפיים הפוכה פנימית כדי להעריך טוב יותר את הצלחת הניתוח במהלך שלב 4 באותה חיה. עם זאת, כריתה של אותו איבר בחיה נפרדת יכולה לשמש גם כבקרה.</li>
</ol>3. החלמה וטיפול לאחר הניתוח
<ol><li>לאחר השלמת הניתוח, מניחים מגבת קימוויפה או מגבת נייר סטרילית בתחתית המיכל או צלחת פטרי כדי להרטיב אותה. מניחים את החיה לתוך המיכל על קרח רטוב בעדינות לעטוף את הקצוות החשופים של Kimwipe או מגבת נייר סביב החלק העליון של החיה כדי לשמור אותו hydrated היטב עם פתרון sulfamerazine. להשאיר על קרח רטוב במשך 30 דקות עד 1 שעה כדי להבטיח תנועה מינימלית במהלך התאוששות מהרדמה.</li>
	<li>מניחים את החיה לתוך מיכל דיור סטטי עם 0.5% תמיסת sulfamerazine. Axolotls חייב להישאר בפתרון זה במשך 24 השעות הראשונות על מנת למנוע זיהום.</li>
	<li>מניחים את האקסולוטל במי מערכת רגילים ומפקחים על הבריאות מדי יום. ודא כי אין תפרים לנשור כל יום כמו זה יכול לגרום אפידרמיס פצע קטן להרכיב אשר יבלבל את התוצאות. הערה: ודא כי מיכל הדיור יש מספיק מקום עבור axolotl לנוע ולמזער את הסיכויים כי הגפה נתפר על האקסולוטל יכול לבוא במגע עם הצדדים של המכולה. זה יעזור להבטיח כי התפרים להישאר במקום, במיוחד במהלך השבוע הראשון לאחר הניתוח.</li>
</ol>4. הערכת הצלחת הניתוח תחת מיקרוסקופ סטריאו
הערה: אנו ממליצים לבדוק בעלי חיים תחת מיקרוסקופ סטריאו לפחות פעם בשבוע כדי להעריך את שלמות דש העור המלא ואת הצלחת הניתוח.
<ol><li>מרדים את האקסולוטל ב-0.1% טריקיין כמו בשלב 2.1. ודא שיש מספיק מקום במיכל עבור האקסולוטל לנוע.</li>
	<li>אם בודקים במהלך השבועיים הראשונים לאחר הניתוח, בדקו את הגפה התפורה באמצעות סטריאומיקרוסקופ כדי לוודא שלא צצו תפרים וכי אפידרמיס פצע דק וברור אינו נראה בשום מקום. אם בודקים בשבוע השלישי שלאחר הניתוח או מאוחר יותר, ודאו שבלסטמה לא נוצרה והשוו לאופן שבו השליטה הרגילה קטועה את הגפה (או מאותו בעל חיים או מבעל חיים אחר) התקדמה במהלך ההתחדשות (כלומר, אם נוצרה בלסטמה).</li>
	<li>בסיום, החזר את האקסולוטל לתנאי מי מערכת וגידול רגילים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Spallanzani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prodromo Di Un'opera Da Imprimersi Sopra Le Riproduzioni Animali. , (1768).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. , (2018).</li><li>Leigh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+landscape+of+the+blastema+niche+in+regenerating+adult+axolotl+limbs+at+single-cell+resolution.">Transcriptomic landscape of the blastema niche in regenerating adult axolotl limbs at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 9 (1), 5153 (2018).</li><li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+limb+blastema:+cellular+and+molecular+mechanisms+driving+blastema+formation+and+limb+regeneration+in+tetrapods.">The axolotl limb blastema: cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods.</a> Regeneration (Oxford). 2 (2), 54-71 (2015).</li><li>Endo, T., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+model+system+for+limb+regeneration.">A stepwise model system for limb regeneration.</a> Developmental Biology. 270 (1), 135-145 (2004).</li><li>Tsai, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+interplay+between+progenitors+and+immune+cells+in+tissue+regeneration+and+homeostasis.">The molecular interplay between progenitors and immune cells in tissue regeneration and homeostasis.</a> Journal of Immunology and Regenerative Medicine. 7, 100024 (2020).</li><li>Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+adult+salamander+limb+regeneration.">Macrophages are required for adult salamander limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).</li><li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+cellular+choreography+of+appendage+regeneration.">The molecular and cellular choreography of appendage regeneration.</a> Cell. 165 (7), 1598-1608 (2016).</li><li>Campbell, L. J., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+epidermis+formation+and+function+in+urodele+amphibian+limb+regeneration.">Wound epidermis formation and function in urodele amphibian limb regeneration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (1), 73-79 (2008).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li><li>Sandoval-Guzman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+differences+in+dedifferentiation+and+stem+cell+recruitment+during+skeletal+muscle+regeneration+in+two+salamander+species.">Fundamental differences in dedifferentiation and stem cell recruitment during skeletal muscle regeneration in two salamander species.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 174-187 (2014).</li><li>Tassava, R. A., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+injury,+nerves,+and+the+wound+epidermis+during+the+initiation+of+amphibian+limb+regeneration.">The roles of injury, nerves, and the wound epidermis during the initiation of amphibian limb regeneration.</a> Differentiation. 4 (1), 23-24 (1975).</li><li>Hay, E. D., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+the+blastema+in+regenerating+limbs+of+the+newt+Triturus+viridescens.+An+autoradiographic+study+using+tritiated+thymidine+to+follow+cell+proliferation+and+migration.">Origin of the blastema in regenerating limbs of the newt Triturus viridescens. An autoradiographic study using tritiated thymidine to follow cell proliferation and migration.</a> Developmental Biology. 3, 26-59 (1961).</li><li>Christensen, R. N., Tassava, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+epithelial+cap+morphology+and+fibronectin+gene+expression+in+regenerating+axolotl+limbs.">Apical epithelial cap morphology and fibronectin gene expression in regenerating axolotl limbs.</a> Developmental Dynamics. 217 (2), 216-224 (2000).</li><li>Repesh, L. A., Oberpriller, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+epidermal+cell+migration+in+wound+healing+during+limb+regeneration+in+the+adult+newt,+Notophthalmus+viridescens.">Scanning electron microscopy of epidermal cell migration in wound healing during limb regeneration in the adult newt, Notophthalmus viridescens.</a> American Journal of Anatomy. 151 (4), 539-555 (1978).</li><li>Neufeld, D. A., Day, F. A., Settles, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+role+of+the+basement+membrane+and+dermal+fibers+during+newt+limb+regeneration.">Stabilizing role of the basement membrane and dermal fibers during newt limb regeneration.</a> Anatomical Record. 245 (1), 122-127 (1996).</li><li>Singer, M., Saltpeter, M. M., Zarrow, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Growth in Living Systems. , (1961).</li><li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+adult+newt+limb+regeneration+of+partial+and+complete+skin+flaps+over+the+amputation+surface.">Effects on adult newt limb regeneration of partial and complete skin flaps over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 195 (1), 117-128 (1976).</li><li>Tassava, R. A., Garling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+responses+in+larval+axolotl+limbs+with+skin+grafts+over+the+amputation+surface.">Regenerative responses in larval axolotl limbs with skin grafts over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 208 (1), 97-110 (1979).</li><li>Tornier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Der+Kampf+der+Gewebe+im+Regeneratbei+Begunsiigung+der+Hautregeneralion.">Der Kampf der Gewebe im Regeneratbei Begunsiigung der Hautregeneralion.</a> Arch. Entwmech. 22, 348-352 (1906).</li><li>Goss, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+inhibition+following+limb+amputation+and+immediate+insertion+into+the+body+cavity.">Regenerative inhibition following limb amputation and immediate insertion into the body cavity.</a> Anatomical Record. 126 (1), 15-27 (1956).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+apical+cap+removal+on+limb+regeneration+in+Amblystoma+larvae.">The effect of apical cap removal on limb regeneration in Amblystoma larvae.</a> Journal of Experimental Zoology. 134 (2), 357-381 (1957).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+limb+regeneration+in+urodele+larvae+by+localized+irradiation+with+ultraviolet+light.">The inhibition of limb regeneration in urodele larvae by localized irradiation with ultraviolet light.</a> Journal of Experimental Zoology. 137 (1), 153-179 (1958).</li><li>Tsai, S. L., Baselga-Garriga, C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+is+a+dual+regulator+of+wound+epidermis+development+and+inflammation+during+the+initiation+of+limb+regeneration.">Midkine is a dual regulator of wound epidermis development and inflammation during the initiation of limb regeneration.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Elewa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+and+editing+the+Pleurodeles+waltl+genome+reveals+novel+features+of+tetrapod+regeneration.">Reading and editing the Pleurodeles waltl genome reveals novel features of tetrapod regeneration.</a> Nature Communications. 8 (1), 2286 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Looso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+de+novo+assembly+of+the+newt+transcriptome+combined+with+proteomic+validation+identifies+new+protein+families+expressed+during+tissue+regeneration.">A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration.</a> Genome Biology. 14 (2), 16 (2013).</li><li>Abdullayev, I., Kirkham, M., Bjorklund, A. K., Simon, A., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reference+transcriptome+and+inferred+proteome+for+the+salamander+Notophthalmus+viridescens.">A reference transcriptome and inferred proteome for the salamander Notophthalmus viridescens.</a> Experimental Cell Research. 319 (8), 1187-1197 (2013).</li><li>Burns, J. A., Zhang, H., Hill, E., Kim, E., Kerney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+illuminates+the+nature+of+the+intracellular+interaction+in+a+vertebrate-algal+symbiosis.">Transcriptome analysis illuminates the nature of the intracellular interaction in a vertebrate-algal symbiosis.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+for+the+study+of+early+processes+of+retinal+regeneration+in+the+adult+newt,+Cynops+pyrrhogaster.">A transcriptome for the study of early processes of retinal regeneration in the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> PLoS One. 9 (10), 109831 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 29 (2), 317-324 (2019).</li><li>Arenas Gomez, C. M., Woodcock, R. M., Smith, J. J., Voss, S. R., Delgado, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transcriptomics+to+enable+a+plethodontid+salamander+(Bolitoglossa+ramosi)+for+limb+regeneration+research.">Using transcriptomics to enable a plethodontid salamander (Bolitoglossa ramosi) for limb regeneration research.</a> BMC Genomics. 19 (704), (2018).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR-Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR-Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Joven, A., Elewa, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+regeneration:+salamanders.">Model systems for regeneration: salamanders.</a> Development. 146 (14), (2019).</li><li>Johnson, K., Bateman, J., DiTommaso, T., Wong, A. Y., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+cell+cycle+activation+is+induced+following+complex+tissue+injury+in+axolotl.">Systemic cell cycle activation is induced following complex tissue injury in axolotl.</a> Developmental Biology. 433 (2), 461-472 (2018).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מאמר זה מתאר פרוטוקול לביצוע ניתוחי דש עור מלאים בגפיים אקסולוטליות כדי לעכב היווצרות אפידרמיס פצע. בעוד ניתוח זה הוא פשוט יחסית מבחינה טכנית לשחזור בהשוואה לשיטות אחרות של עיכוב היווצרות אפידרמיס הפצע, ישנם מספר צעדים קריטיים שיכולים להשפיע על הצלחת הניתוח. ראשית, כאשר מושכים את דש העור המלא שלם מעל הרקמות הבסיסיות החשופות, יש חשיבות עליונה כי העור בעובי מלא לא להיפגע בכל דרך. נזק לדש העור עדיין יכול להוביל להיווצרות אפידרמיס פצע קטן, אשר יכול לגרום יבול קטן דמוי blastema. שנית, להבטיח תפרים לא לנשור במהלך טיפול לאחר הניתוח כמו זה יכול גם להוביל להיווצרות של אפידרמיס פצע קטן. עד לנקודה זו, חשוב למזער את המגע הפוטנציאלי בין הגפה התפורה לבין כל המשטחים, במיוחד במהלך השבוע הראשון שלאחר הניתוח. מספר דרכים למנוע את זה כרוך דיור והרדמה האקסולוטל במיכל גדול מספיק, כך axolotl יש שפע של מקום לנוע לאחר הניתוח.
לניתוח זה יש גם מספר מגבלות. אולי הבולט ביותר הוא כי ההצלחה של ניתוחים ניתן להעריך רק בשתי דרכים: באמצעות היקף ניתוח במהלך השבועיים הראשונים של הניתוח כדי לחפש היעדר אפידרמיס פצע ו / או לבדוק אם blastema צורות בתוך 3 שבועות. בעוד שיטות אלה יעילות, הם תפוקה נמוכה יחסית. הפיתוח של אקסולוטלים עיתונאיים מהונדסים עתידיים עבור סמנים ספציפיים לאפידרמיס פצע עשוי לסייע בהקרנה מהירה יותר לניתוחים מוצלחים לעומת לא מוצלחים. יתר על כן, ניתוח זה קשה יותר לביצוע על בעלי חיים צעירים יותר כמו העור שלם הוא שביר יותר. לכן מומלץ להשתמש באקסולוטלים תת-מבוגרים או מבוגרים.
בעוד ניתוח זה פותח במקור N. viridiscens19, זה כבר מותאם בקלות עבור axolotls25,39 והוא יכול להיות מיושם ככל הנראה על מינים אחרים סלמנדרה גם כן. לסיכום, יישום טכניקה זו על מחקרים עתידיים של התחדשות גפיים יעצים את החוקרים הן לפתח כלים נוספים לטיפול בביולוגיה של אפידרמיס הפצע ולזהות את המנגנונים הבסיסיים המניעים את תפקידה בייזום היווצרות blastema.

מאז Lazzaro Spallanzani דיווח על כך בשנת 17681, התחדשות גפי סלמנדרה כבר אחת התופעה הרגנרטיבית הטבעית הנחקרת ביותר כי יש מאוהב ביולוגים במשך מאות שנים. התחדשות גפיים מוצלחת תלויה בהיווצרות, בצמיחה ובדפוסים הבאים של מבנה תאי בלתי מובחן המכונה הבלסטמה. חוקרים עשו צעדים משמעותיים בהבנת ההרכב התאי של הבלסטמה, כמו גם אילו רקמות תומכות וסוגי תאים נחוצים להיווצרותה2,3,4,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . עם זאת, מנגנוני האיתות המתואמים בין רקמות וסוגי תאים שונים המובילים לייזום היווצרות blastema נשארים מובנים היטב.
דרישה מרכזית להיווצרות והתחדשות מוצלחת של בלסטמה היא אפידרמיס הפצע, אפיתל ארעי ומתמחה המכסה את מישור הקטיעה תוך 12 שעות לאחר הקטיעה10. לאחר קטיעה, תאי אפיתל מהעור השלם קרוב לפציעה נודדים במהירות מעל מישור הקטיעה כדי ליצור אפיתל פצע דק14. כאשר הבלסטמה נוצרת בשבועות הבאים, אפידרמיס הפצע המוקדם מתפתח למבנה איתות אפיתל עבה יותר הנקרא כובע אפיתל אפיתל apical (AEC)15. בעוד עור רגיל בעובי מלא מכיל הן שכבה אפיתל והן שכבה עורית המופרדת על ידי למינה בסיסית, אפידרמיס הפצע / AEC מורכב רק משכבה אפיתל וחסר למינה בסיסית16,17. היעדר הלמינה הבסיסית והדרמיס מאפשר מגע ישיר בין תאי האפיתל של הפצע לבין הרקמות הבסיסיות, מה שמאפשר איתות דו-כיווני בין שני התאים הקריטיים הן להיווצרות הבלסטמה והן לתחזוקה17,18.
מחקרים ניסיוניים קלאסיים המציאו שיטות כירורגיות חדשניות שונות לבדיקת תפקוד אפידרמיס / AEC פצעים והכרח באמצעות עיכוב היווצרותו. שיטות אלה כללו תפירה19 או השתלת עור בעובי מלא20,21 מעל מישור הקטיעה, תפירה מיידית של הגפה הכרותה לחלל הגוף22, והסרה יומית מתמשכת או הקרנה של אפידרמיס הפצע המוקדם ו- AEC23,24. בסך הכל, ניסויים אלה לא רק ביססו את החשיבות של אפידרמיס הפצע / AEC, אלא גם קבעו עוד יותר את תפקידיו בהיסטוליזה מוקדמת של רקמות, כמו גם שמירה על התפשטות תאי האבות וצמיחת הבלסטם 13 לאורך ההתחדשות.
עם זאת, מחקרים קודמים אלה הוגבלו במידה רבה כתמים היסטולוגיים, כמו גם פולסים thymidine tritiated כדי לעקוב אחר התפשטות התא. למעשה, בחינה מחודשת של ניסויים קלאסיים אלה עם טכנולוגיות ריצוף מודרניות וטכניקות פונקציונליות בסלמנדרות נעשתה רק לאחרונה והובילה לגילוי תפקידים נוספים לאפידירמיס הפצע בהתכווצות דלקת ו- ECM השפלה / תצהיר בשלבים מוקדמים של התחדשות25. עם שחרורו של גנום סלמנדרה שונים ורצפי תמלול26,27,28,29,30,31,32,32,33,34, כמו גם המספר המתפתח של שיטות פונקציונליות הזמינות במיני סלמנדרה11,35,36,37,38 החוקרים ממוקמים כעת היטב כדי להתחיל לפענח את המנגנונים המולקולריים המניעים היווצרות אפידרמיס פצעים, פונקציה ופיתוח AEC.,
למרבה הצער, כמה מהשיטות הקלאסיות הללו המשמשות לעיכוב היווצרות אפידרמיס הפצע הן מאתגרות מבחינה טכנית, ומציגות קשיים לשחזור בין משכפלים ביולוגיים באותו ניסוי. לדוגמה, שמירה על שתלי עור יכולה להיות מאתגרת שכן שתלים עלולים בסופו של דבר ליפול מהגפה המארחת והסרת אפידרמיס הפצע / AEC מדי יום קשה מבלי לפגוע ברקמות הבסיסיות. יתר על כן, תפירת האיבר הקטוע לחלל הגוף היא מאתגרת וגם דורשת פגיעה נוספת באתר ההחדרה. מצד שני, תפירת עור בעובי מלא מיד מעל מישור הקטיעה היא פשוטה יחסית, ניתנת לשחזור מבחינה טכנית, ומציגה נזק מינימלי לרקמות. שיטה כירורגית מלאה זו של דש העור (FSF) פותחה בעבר על ידי אנתוני משר בשנת 1976 בחדשות בוגרות (Notophthalmus viridiscens). הוא הוכיח כי ניתוח FSF עיכב היווצרות אפידרמיס פצע ותפקוד על ידי איסור הן הגירת תאי אפיתל מעל מישור הקטיעה והן מגע ישיר בין תאי האפיתל לבין הרקמות הבסיסיות.
כאן, הליך כירורגי זה מוצג צעד אחר צעד באמצעות איבר axolotl. יחד עם טכנולוגיות מולקולריות ורצף מודרניות, טכניקה זו עשויה להיות מועילה מאוד לחוקרים כדי להעמיק את הבנתנו של אפידרמיס הפצע / AEC היווצרות ותפקוד במהלך התחדשות הגפיים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Curved spring scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td>Need two pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon monofilament sutures (9-0)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>SUT-1000-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamerazine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>127-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration

ניסויים קלאסיים בביולוגיה רגנרטיבית סלמנדרה במאה האחרונה קבעו זה מכבר כי אפידרמיס הפצע הוא מבנה איתות מכריע שנוצר במהירות לאחר קטיעה ונדרש להתחדשות גפיים. עם זאת, שיטות ללמוד את תפקודו המדויק ברמה המולקולרית בעשורים האחרונים הוגבלו בשל דלות של טכניקות פונקציונליות מדויקות ומידע גנומי זמין במערכות מודל סלמנדרה. באופן מרגש, שפע טכנולוגיות הרצף האחרונות יחד עם שחרורם של גנומי סלמנדרה שונים והופעתן של שיטות בדיקה גנטיות פונקציונליות, כולל CRISPR, מאפשרות לבקר מחדש בניסויים בסיסיים אלה ברזולוציה מולקולרית חסרת תקדים. כאן, אני מתאר כיצד לבצע את ניתוח דש העור המלא שפותח באופן קלאסי (FSF) באקסולוטלים למבוגרים על מנת לעכב היווצרות אפידרמיס פצע מיד לאחר הקטיעה. האפידרמיס הפצע נוצר בדרך כלל באמצעות הגירה דיסטלית של תאי אפיתל בעור קרוב למישור הקטיעה כדי לאטום את הפצע מהסביבה החיצונית. הניתוח כרוך בתפירה מיידית של עור בעובי מלא (הכולל הן שכבות אפידרמיס והן שכבות עוריות) מעל מישור הקטיעה כדי לעכב את נדידת תאי האפיתל ומגע עם רקמות המזנכימל הפגומות שבבסיסן. ניתוחים מוצלחים גורמים לעיכוב היווצרות בלסטמה והתחדשות גפיים. על ידי שילוב של שיטת ניתוח זו עם ניתוחים מולקולריים ותפקודיים עכשוויים במורד הזרם, החוקרים יכולים להתחיל לחשוף את היסודות המולקולריים של תפקוד אפידרמיס הפצע וביולוגיה במהלך התחדשות הגפיים.

פרוטוקול כירורגי זה יאפשר עיכוב מלא של היווצרות אפידרמיס הפצע (איור 1) ובסופו של דבר, התחדשות גפיים. ניתוח מוצלח גורם ללא היווצרות blastema בכ 2-3 שבועות בהתאם לגודל של החיה, בעוד שליטה בגפיים מתחדשות צריך ליצור blastema בדרך כלל.
החוקרים צריכים לבדוק את האיבר התפור בעין בלתי כל 2-3 ימים כדי לוודא כי התפרים לא יצאו החוצה וכי blastema אינו נוצר. אם אחד או יותר מהתפרים צצים החוצה, אפידרמיס פצע עדיין יכול להיווצר וכתוצאה מכך בלסטמה קטנה או גדולה וניתוח לא מוצלח (איור 2). בנוסף, החוקרים צריכים לבדוק את האיבר התפור לפחות פעם בשבוע תחת סטריאומיקרוסקופ כדי לוודא כי אפידרמיס פצע דק לא ניכר בשום מקום על פני השטח קטוע. לשם השוואה, החוקרים צריכים גם לבחון את השליטה מתחדשת איבר אשר צריך להיות אפידרמיס פצע מעל מטוס קטיעה וליצור blastema מעל 2-3 שבועות. האפידרמיס הפצע ייראה דק וברור, בעוד העור הרגיל ייראה אטום יותר ורוד חיוור (כמעט לבן), צהוב בהיר, או ירוק כהה באקסולוטלים לאוציסטיים, לבקניים או פראיים, בהתאמה.
אם החוקרים רוצים לאסוף רקמות לפני שלבי היווצרות blastema ב 2-3 שבועות, הם צריכים לבדוק את הגפיים נתפרו לפני איסוף מדגם כדי לוודא התפרים נשארו במקום וכי אפידרמיס פצע קטן לא נוצר. בנוסף, חלוקה סגיטית דרך רקמת הגפיים התפורה וביצוע ניתוחים היסטולוגיים בכל נקודת זמן יכולים גם לאמת את נוכחותו של הדרמיס מדש העור המלא המקיף את כל מישור הקטיעה והיעדר אפידרמיס פצע (איור 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> איור 1: סכמטי של השלבים של ניתוח דש העור המלא. שלבי הפרוטוקול ממוספרים ומסומנים כאן בדיאגרמה. הקווים המקווקו מציינים את מישורי הקטיעה בשלבים 1 ו- 3 של הפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> איור 2: דוגמאות לניתוחים מוצלחים ולא מוצלחים של דש עור מלא. תמונת ברייטפילד מייצגת של איבר שעבר ניתוח מוצלח (משמאל), ניתוח לא מוצלח (מימין) וגפה מתחדשת שליטה (ללא ניתוח) ב 25 ימים לאחר כריתה (dpa). הניתוח המוצלח כולל מישור קטיעה שטוח שבו נתפר דש העור המלא, ואילו הניתוח הלא מוצלח יש blastema קטן מתפתח. ראשי חץ מציינים את מישור הקטיעה וקווים מנוקדים לבנים נמצאים שם כדי לסייע בהדמיה של היעדר בלסטמה בניתוח המוצלח ונוכחות של blastemas בניתוח לא מוצלח ושליטה על גפיים מתחדשות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> איור 3: כתמים היסטולוגיים של התחדשות רגילה וגפיים נתפרו FSF. (א-ב') תמונות ברייטפילד מייצגות של קטעים מוכתמים של פיקרו-מלורי מהתחדשות (A-A') וגפיים אקסולוטליות תפורות (B-B') ב-7 dpa. כניסות ב - A ו - B מוצגות ב - A ו - B', בהתאמה. שכבת העור הכבדה בקולגן מכסה את כל מישור הקטיעה בגפיים נתפרו. מישור קטיעה מסומן על ידי ראשי חץ ב - A-B. סרגלי קנה מידה מייצגים 500 מיקרומטר. נתון זה הותאם מ-Tsai et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration at JoVE.com

Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

מאמר זה מתאר כיצד לבצע שיטה כירורגית לעכב היווצרות אפידרמיס הפצע במהלך התחדשות הגפיים axolotl על ידי תפירת עור בעובי מלא באופן מיידי מעל מישור הקטיעה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקידים התפקודיים של אפידרמיס הפצע בשלבים המוקדמים של התחדשות הגפיים.

עיכוב של היווצרות אפידרמיס הפצע באמצעות ניתוח דש עור מלא במהלך התחדשות הגפיים Axolotl

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

inhibition-wound-epidermis-formation-via-full-skin-flap-surgery

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

3.0K Views.  Harvard University. מאמר זה מתאר כיצד לבצע שיטה כירורגית לעכב היווצרות אפידרמיס הפצע במהלך התחדשות הגפיים axolotl על ידי תפירת עור בעובי מלא באופן מיידי מעל מישור הקטיעה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקידים התפקודיים של אפידרמיס הפצע בשלבים המוקדמים של התחדשות הגפיים.

Video: Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

גישה גנטית הפוך כדי בדיקת יתירות פונקציונלית במהלך embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

הגורל מיפוי בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי גיבוש תפלצת

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

מדידת כוח במהלך התכווצות כדי להעריך את תפקוד שריר בזחלי דג הזברה

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the resolution of peripheral tissue responses. While a variety of methods are used to quantify leukocyte egress from non-lymphoid, peripheral tissues, the cellular and molecular mechanisms that govern context-dependent egress remain poorly understood. Here, we describe the use of in situ photoconversion for quantitative analysis of leukocyte egress from murine skin and tumors. Photoconversion allows for the direct labeling of leukocytes resident within cutaneous tissue. Though skin exposure to violet light induces local inflammatory responses characterized by leukocyte infiltrates and vascular leakiness, in a head-to-head comparison with transdermal application of fluorescent tracers, photoconversion specifically labeled migratory dendritic cell populations and simultaneously enabled the quantification of myeloid and lymphoid egress from cutaneous microenvironments and tumors. The mechanisms of leukocyte egress remain a missing component in our understanding of intratumoral leukocyte complexity, and thus the application of the tools described herein will provide unique insight into the dynamics of tumor immune microenvironments both at steady state and in response to therapy.

Here, we demonstrate the methods for in vivo quantification of leukocyte egress from na&#239;ve, inflamed, and malignant murine skin. We perform a head-to-head comparison of two models: transdermal FITC application and in situ photoconversion. Furthermore, we demonstrate the utility of photoconversion for tracking leukocyte egress from cutaneous tumors.

לכימות ליקוציט היציאה דרך כלי הלימפה מ מאתר עור וגידולים

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...