Name: inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration
Uploaded: 2020-06-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration at JoVE.com

המחבר מודה לדאג על עידודו המתמיד והתמיכה הבלתי מעורערת שלו, כמו גם לחברי מעבדת מלטון על המשוב וההערות המועילות שלהם על כתב היד. המחבר רוצה גם להודות למשרד משאבי בעלי החיים של הרווארד (OAR) על הטיפול המסור בבעלי חיים.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם ל- IACUC (פרוטוקול #: 11-32) והנחיות AAALAC באוניברסיטת הרווארד.
1. הכנת פתרונות והתקנה להרדמה והחלמה
<ol><li>הכן תמיסת טרי 0.1% tricaine להרדמה ו 0.5% תמיסת מלח נתרן סולפראזין להתאוששות. הפוך את הפתרונות באמצעות מים מתאימים לגידול אקסולוטל37 על פי פרוטוקולי IACUC מאושרים במכון המחקר הרלוונטי (הפתרון של Holtfreter שונה, למשל). ודא כי הפתרונות מעורבים היטב וכי נפח מספיק מוכן על מנת להטביע את האקסולוטל כולו.<ol>
<li>כדי להכין 0.1% פתרון tricaine, לערבב 1 גרם של tricaine ו 1 גרם של סודיום ביקרבונט עם 1 L של מים. הפתרון ניתן לשנות את קנה המידה על פי מתכון זה.</li>
		<li>כדי להכין 0.5% תמיסת מלח נתרן סולפאמרזין, לערבב 5 גרם של מלח נתרן sulfamerazine עם 1 L של מים. הפתרון ניתן לשנות את קנה המידה על פי מתכון זה. תמיסת סולפאמרזין היא אנטי-ביוטית שתמנע זיהום חיידקי במהלך ההחלמה הכירורגית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחטא את האזור הכירורגי על ידי ריסוס אותו עם Clidox-S או 70% אתנול. לחטא כלים כירורגיים (מלקחיים, לנתח מספריים, מספריים קפיץ) על ידי autoclaving. אם אתם מבצעים ניתוחים מרובים, הקפידו לחטא את הכלים הכירורגיים בעזרת מחטא חרוזים חם בין בעלי חיים.</li>
	<li>כדי להגדיר את אזור ההתאוששות, מניחים צלחת פטרי 15 ס"מ או כל מיכל שיתאים axolotl על גבי דלי מלא קרח רטוב. ממלאים את צלחת הפטרי ברמה נמוכה של 0.5% תמיסת מלח נתרן סולפרזין, מספיק כדי שהאקסולוטל לא יהיה שקוע לחלוטין. ההתאוששות על הקרח לאחר הניתוח תאט את תנועת החיה בזמן שהיא מתעוררת מהרדמה, ומאפשרת לאזור התפור להחלים באופן יחסי ללא הפרעה. הערה: הגדרה זו יכולה להיות מותאמת אישית על ידי חוקרים בהתאם לחומרים שיש להם זמינים.</li>
</ol>2. ביצוע ההליך הכירורגי מלא דש העור
<ol><li>להרדים את האקסולוטל על ידי טבילתו במיכל של 0.1% פתרון tricaine. הנסיעה אורכת כ-15-20 דקות. ודא כי האקסולוטל אכן מורדם לחלוטין על ידי ביצוע צביטת זנב. אם אין תגובה מהאקסולוטל, המשך בניתוח. הערה: יש להשתמש באקסולוטלים ישנים וגדולים יותר לניתוח זה (בגודל של לפחות 15 ס"מ). ודא כי האקסולוטל נשאר hydrated היטב לאורך כל הניתוח על ידי הרטבת העור מעת לעת עם מי מערכת axolotl באמצעות פיפטה פלסטיק. הקפידו להכין באופן אספטי את האתר הכירורגי על ידי השקיית האזור עם PBS סטרילי לפני הניתוח. החיה צריכה גם להיות ממוקמת על וילון כירורגי סטרילי עבור ההליך.</li>
	<li>בצעו קטיעת גפיים בקצה הדיסטלי של יסודות השלד הזוגופודיאליים באמצעות המספריים המנתחים (איור 1.1).</li>
	<li>בעזרת המספריים הקפיציים, בצעו חתך קטן (כ-2 מ"מ) בחלק הגחוני של העור (איור 1.2).</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, לקלף בזהירות את העור אל קו האמצע של יסודות השלד zeugopodial, חשיפת רקמות הגפיים הבסיסיות (שריר, עצם, וכו ') (איור 1.3). הקפד לא לפגוע בעור. ראה הערה לאחר שלב 2.8.</li>
	<li>כרתו את רקמות הגפיים החשופות בקו האמצע של הזוגופוד באמצעות מספריים כירורגיות (איור 1.4).</li>
	<li>לדחוף בחזרה את רקמת השריר עם המספריים כירורגיים לקצץ את העצם החשופה. הערה: זה הכרחי כדי להבטיח ריפוי משופר וגם כדי להגדיל את ההצלחה של הניתוח כמו עצם בולטת יכול להיות משונן נגד דש נתפר ולשבש את השלמות של דש עור שלם בהמשך.</li>
	<li>בעזרת המלקחיים, משכו בזהירות את העור בעובי מלא במיוחד מעל מישור הקטיעה כדי לכסות את הרקמות הבסיסיות החשופות ולתפור במקום על ידי חיבור לעור בעובי מלא גחון (איור 1.5).</li>
	<li>תפרו את הצד הימני והשמאלי הנותרים של דש העור לתוך החלקים הגחוניים הבסיסיים של עור שלם. ניתן לעשות זאת על ידי תפירת צידי הדש באופן "מוצלב" (מומלץ) (איור 1.6.6.9), או פשוט תפירה היישר לתוך עור הגחון. השתמש במלקחיים ובמספריים קפיץ מעוקלים לתפירה. ודא כי לא ניתן לראות רקמות בסיסיות חשופות וכי התפרים קשורים בחוזקה (קשורה לפחות שלוש פעמים). הערה: חשוב שהעור השלם לא ייפגע בשלבים 2.4, 2.7-2.8. מצאנו כי נזק לעור בעובי מלא כבר בקורלציה עם ניתוחים לא מוצלחים, כמו אזורי הנזק עדיין עשויים ליצור אפידרמיס פצע קטן. במידת האפשר, נסו להשתמש בזוג מלקחיים עמומים יותר בעת מסירת דש העור בעובי מלא.</li>
	<li>בצע קטיעה על הגפה הנגדית (פיקוח פנימי אופציונלי על בעלי חיים) על ידי כריתתו ברמה באמצע zeugopod עם מספריים כירורגיים. לדחוף בחזרה את רקמת השריר עם מספריים כירורגיים לקצץ את העצם החשופה. הערה: ניתן לעשות בקרת גפיים הפוכה פנימית כדי להעריך טוב יותר את הצלחת הניתוח במהלך שלב 4 באותה חיה. עם זאת, כריתה של אותו איבר בחיה נפרדת יכולה לשמש גם כבקרה.</li>
</ol>3. החלמה וטיפול לאחר הניתוח
<ol><li>לאחר השלמת הניתוח, מניחים מגבת קימוויפה או מגבת נייר סטרילית בתחתית המיכל או צלחת פטרי כדי להרטיב אותה. מניחים את החיה לתוך המיכל על קרח רטוב בעדינות לעטוף את הקצוות החשופים של Kimwipe או מגבת נייר סביב החלק העליון של החיה כדי לשמור אותו hydrated היטב עם פתרון sulfamerazine. להשאיר על קרח רטוב במשך 30 דקות עד 1 שעה כדי להבטיח תנועה מינימלית במהלך התאוששות מהרדמה.</li>
	<li>מניחים את החיה לתוך מיכל דיור סטטי עם 0.5% תמיסת sulfamerazine. Axolotls חייב להישאר בפתרון זה במשך 24 השעות הראשונות על מנת למנוע זיהום.</li>
	<li>מניחים את האקסולוטל במי מערכת רגילים ומפקחים על הבריאות מדי יום. ודא כי אין תפרים לנשור כל יום כמו זה יכול לגרום אפידרמיס פצע קטן להרכיב אשר יבלבל את התוצאות. הערה: ודא כי מיכל הדיור יש מספיק מקום עבור axolotl לנוע ולמזער את הסיכויים כי הגפה נתפר על האקסולוטל יכול לבוא במגע עם הצדדים של המכולה. זה יעזור להבטיח כי התפרים להישאר במקום, במיוחד במהלך השבוע הראשון לאחר הניתוח.</li>
</ol>4. הערכת הצלחת הניתוח תחת מיקרוסקופ סטריאו
הערה: אנו ממליצים לבדוק בעלי חיים תחת מיקרוסקופ סטריאו לפחות פעם בשבוע כדי להעריך את שלמות דש העור המלא ואת הצלחת הניתוח.
<ol><li>מרדים את האקסולוטל ב-0.1% טריקיין כמו בשלב 2.1. ודא שיש מספיק מקום במיכל עבור האקסולוטל לנוע.</li>
	<li>אם בודקים במהלך השבועיים הראשונים לאחר הניתוח, בדקו את הגפה התפורה באמצעות סטריאומיקרוסקופ כדי לוודא שלא צצו תפרים וכי אפידרמיס פצע דק וברור אינו נראה בשום מקום. אם בודקים בשבוע השלישי שלאחר הניתוח או מאוחר יותר, ודאו שבלסטמה לא נוצרה והשוו לאופן שבו השליטה הרגילה קטועה את הגפה (או מאותו בעל חיים או מבעל חיים אחר) התקדמה במהלך ההתחדשות (כלומר, אם נוצרה בלסטמה).</li>
	<li>בסיום, החזר את האקסולוטל לתנאי מי מערכת וגידול רגילים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Spallanzani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prodromo Di Un'opera Da Imprimersi Sopra Le Riproduzioni Animali. , (1768).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. , (2018).</li><li>Leigh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+landscape+of+the+blastema+niche+in+regenerating+adult+axolotl+limbs+at+single-cell+resolution.">Transcriptomic landscape of the blastema niche in regenerating adult axolotl limbs at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 9 (1), 5153 (2018).</li><li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+limb+blastema:+cellular+and+molecular+mechanisms+driving+blastema+formation+and+limb+regeneration+in+tetrapods.">The axolotl limb blastema: cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods.</a> Regeneration (Oxford). 2 (2), 54-71 (2015).</li><li>Endo, T., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+model+system+for+limb+regeneration.">A stepwise model system for limb regeneration.</a> Developmental Biology. 270 (1), 135-145 (2004).</li><li>Tsai, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+interplay+between+progenitors+and+immune+cells+in+tissue+regeneration+and+homeostasis.">The molecular interplay between progenitors and immune cells in tissue regeneration and homeostasis.</a> Journal of Immunology and Regenerative Medicine. 7, 100024 (2020).</li><li>Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+adult+salamander+limb+regeneration.">Macrophages are required for adult salamander limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).</li><li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+cellular+choreography+of+appendage+regeneration.">The molecular and cellular choreography of appendage regeneration.</a> Cell. 165 (7), 1598-1608 (2016).</li><li>Campbell, L. J., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+epidermis+formation+and+function+in+urodele+amphibian+limb+regeneration.">Wound epidermis formation and function in urodele amphibian limb regeneration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (1), 73-79 (2008).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li><li>Sandoval-Guzman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+differences+in+dedifferentiation+and+stem+cell+recruitment+during+skeletal+muscle+regeneration+in+two+salamander+species.">Fundamental differences in dedifferentiation and stem cell recruitment during skeletal muscle regeneration in two salamander species.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 174-187 (2014).</li><li>Tassava, R. A., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+injury,+nerves,+and+the+wound+epidermis+during+the+initiation+of+amphibian+limb+regeneration.">The roles of injury, nerves, and the wound epidermis during the initiation of amphibian limb regeneration.</a> Differentiation. 4 (1), 23-24 (1975).</li><li>Hay, E. D., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+the+blastema+in+regenerating+limbs+of+the+newt+Triturus+viridescens.+An+autoradiographic+study+using+tritiated+thymidine+to+follow+cell+proliferation+and+migration.">Origin of the blastema in regenerating limbs of the newt Triturus viridescens. An autoradiographic study using tritiated thymidine to follow cell proliferation and migration.</a> Developmental Biology. 3, 26-59 (1961).</li><li>Christensen, R. N., Tassava, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+epithelial+cap+morphology+and+fibronectin+gene+expression+in+regenerating+axolotl+limbs.">Apical epithelial cap morphology and fibronectin gene expression in regenerating axolotl limbs.</a> Developmental Dynamics. 217 (2), 216-224 (2000).</li><li>Repesh, L. A., Oberpriller, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+epidermal+cell+migration+in+wound+healing+during+limb+regeneration+in+the+adult+newt,+Notophthalmus+viridescens.">Scanning electron microscopy of epidermal cell migration in wound healing during limb regeneration in the adult newt, Notophthalmus viridescens.</a> American Journal of Anatomy. 151 (4), 539-555 (1978).</li><li>Neufeld, D. A., Day, F. A., Settles, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+role+of+the+basement+membrane+and+dermal+fibers+during+newt+limb+regeneration.">Stabilizing role of the basement membrane and dermal fibers during newt limb regeneration.</a> Anatomical Record. 245 (1), 122-127 (1996).</li><li>Singer, M., Saltpeter, M. M., Zarrow, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Growth in Living Systems. , (1961).</li><li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+adult+newt+limb+regeneration+of+partial+and+complete+skin+flaps+over+the+amputation+surface.">Effects on adult newt limb regeneration of partial and complete skin flaps over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 195 (1), 117-128 (1976).</li><li>Tassava, R. A., Garling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+responses+in+larval+axolotl+limbs+with+skin+grafts+over+the+amputation+surface.">Regenerative responses in larval axolotl limbs with skin grafts over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 208 (1), 97-110 (1979).</li><li>Tornier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Der+Kampf+der+Gewebe+im+Regeneratbei+Begunsiigung+der+Hautregeneralion.">Der Kampf der Gewebe im Regeneratbei Begunsiigung der Hautregeneralion.</a> Arch. Entwmech. 22, 348-352 (1906).</li><li>Goss, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+inhibition+following+limb+amputation+and+immediate+insertion+into+the+body+cavity.">Regenerative inhibition following limb amputation and immediate insertion into the body cavity.</a> Anatomical Record. 126 (1), 15-27 (1956).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+apical+cap+removal+on+limb+regeneration+in+Amblystoma+larvae.">The effect of apical cap removal on limb regeneration in Amblystoma larvae.</a> Journal of Experimental Zoology. 134 (2), 357-381 (1957).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+limb+regeneration+in+urodele+larvae+by+localized+irradiation+with+ultraviolet+light.">The inhibition of limb regeneration in urodele larvae by localized irradiation with ultraviolet light.</a> Journal of Experimental Zoology. 137 (1), 153-179 (1958).</li><li>Tsai, S. L., Baselga-Garriga, C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+is+a+dual+regulator+of+wound+epidermis+development+and+inflammation+during+the+initiation+of+limb+regeneration.">Midkine is a dual regulator of wound epidermis development and inflammation during the initiation of limb regeneration.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Elewa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+and+editing+the+Pleurodeles+waltl+genome+reveals+novel+features+of+tetrapod+regeneration.">Reading and editing the Pleurodeles waltl genome reveals novel features of tetrapod regeneration.</a> Nature Communications. 8 (1), 2286 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Looso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+de+novo+assembly+of+the+newt+transcriptome+combined+with+proteomic+validation+identifies+new+protein+families+expressed+during+tissue+regeneration.">A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration.</a> Genome Biology. 14 (2), 16 (2013).</li><li>Abdullayev, I., Kirkham, M., Bjorklund, A. K., Simon, A., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reference+transcriptome+and+inferred+proteome+for+the+salamander+Notophthalmus+viridescens.">A reference transcriptome and inferred proteome for the salamander Notophthalmus viridescens.</a> Experimental Cell Research. 319 (8), 1187-1197 (2013).</li><li>Burns, J. A., Zhang, H., Hill, E., Kim, E., Kerney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+illuminates+the+nature+of+the+intracellular+interaction+in+a+vertebrate-algal+symbiosis.">Transcriptome analysis illuminates the nature of the intracellular interaction in a vertebrate-algal symbiosis.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+for+the+study+of+early+processes+of+retinal+regeneration+in+the+adult+newt,+Cynops+pyrrhogaster.">A transcriptome for the study of early processes of retinal regeneration in the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> PLoS One. 9 (10), 109831 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 29 (2), 317-324 (2019).</li><li>Arenas Gomez, C. M., Woodcock, R. M., Smith, J. J., Voss, S. R., Delgado, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transcriptomics+to+enable+a+plethodontid+salamander+(Bolitoglossa+ramosi)+for+limb+regeneration+research.">Using transcriptomics to enable a plethodontid salamander (Bolitoglossa ramosi) for limb regeneration research.</a> BMC Genomics. 19 (704), (2018).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR-Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR-Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Joven, A., Elewa, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+regeneration:+salamanders.">Model systems for regeneration: salamanders.</a> Development. 146 (14), (2019).</li><li>Johnson, K., Bateman, J., DiTommaso, T., Wong, A. Y., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+cell+cycle+activation+is+induced+following+complex+tissue+injury+in+axolotl.">Systemic cell cycle activation is induced following complex tissue injury in axolotl.</a> Developmental Biology. 433 (2), 461-472 (2018).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מאמר זה מתאר פרוטוקול לביצוע ניתוחי דש עור מלאים בגפיים אקסולוטליות כדי לעכב היווצרות אפידרמיס פצע. בעוד ניתוח זה הוא פשוט יחסית מבחינה טכנית לשחזור בהשוואה לשיטות אחרות של עיכוב היווצרות אפידרמיס הפצע, ישנם מספר צעדים קריטיים שיכולים להשפיע על הצלחת הניתוח. ראשית, כאשר מושכים את דש העור המלא שלם מעל הרקמות הבסיסיות החשופות, יש חשיבות עליונה כי העור בעובי מלא לא להיפגע בכל דרך. נזק לדש העור עדיין יכול להוביל להיווצרות אפידרמיס פצע קטן, אשר יכול לגרום יבול קטן דמוי blastema. שנית, להבטיח תפרים לא לנשור במהלך טיפול לאחר הניתוח כמו זה יכול גם להוביל להיווצרות של אפידרמיס פצע קטן. עד לנקודה זו, חשוב למזער את המגע הפוטנציאלי בין הגפה התפורה לבין כל המשטחים, במיוחד במהלך השבוע הראשון שלאחר הניתוח. מספר דרכים למנוע את זה כרוך דיור והרדמה האקסולוטל במיכל גדול מספיק, כך axolotl יש שפע של מקום לנוע לאחר הניתוח.
לניתוח זה יש גם מספר מגבלות. אולי הבולט ביותר הוא כי ההצלחה של ניתוחים ניתן להעריך רק בשתי דרכים: באמצעות היקף ניתוח במהלך השבועיים הראשונים של הניתוח כדי לחפש היעדר אפידרמיס פצע ו / או לבדוק אם blastema צורות בתוך 3 שבועות. בעוד שיטות אלה יעילות, הם תפוקה נמוכה יחסית. הפיתוח של אקסולוטלים עיתונאיים מהונדסים עתידיים עבור סמנים ספציפיים לאפידרמיס פצע עשוי לסייע בהקרנה מהירה יותר לניתוחים מוצלחים לעומת לא מוצלחים. יתר על כן, ניתוח זה קשה יותר לביצוע על בעלי חיים צעירים יותר כמו העור שלם הוא שביר יותר. לכן מומלץ להשתמש באקסולוטלים תת-מבוגרים או מבוגרים.
בעוד ניתוח זה פותח במקור N. viridiscens19, זה כבר מותאם בקלות עבור axolotls25,39 והוא יכול להיות מיושם ככל הנראה על מינים אחרים סלמנדרה גם כן. לסיכום, יישום טכניקה זו על מחקרים עתידיים של התחדשות גפיים יעצים את החוקרים הן לפתח כלים נוספים לטיפול בביולוגיה של אפידרמיס הפצע ולזהות את המנגנונים הבסיסיים המניעים את תפקידה בייזום היווצרות blastema.

מאז Lazzaro Spallanzani דיווח על כך בשנת 17681, התחדשות גפי סלמנדרה כבר אחת התופעה הרגנרטיבית הטבעית הנחקרת ביותר כי יש מאוהב ביולוגים במשך מאות שנים. התחדשות גפיים מוצלחת תלויה בהיווצרות, בצמיחה ובדפוסים הבאים של מבנה תאי בלתי מובחן המכונה הבלסטמה. חוקרים עשו צעדים משמעותיים בהבנת ההרכב התאי של הבלסטמה, כמו גם אילו רקמות תומכות וסוגי תאים נחוצים להיווצרותה2,3,4,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . עם זאת, מנגנוני האיתות המתואמים בין רקמות וסוגי תאים שונים המובילים לייזום היווצרות blastema נשארים מובנים היטב.
דרישה מרכזית להיווצרות והתחדשות מוצלחת של בלסטמה היא אפידרמיס הפצע, אפיתל ארעי ומתמחה המכסה את מישור הקטיעה תוך 12 שעות לאחר הקטיעה10. לאחר קטיעה, תאי אפיתל מהעור השלם קרוב לפציעה נודדים במהירות מעל מישור הקטיעה כדי ליצור אפיתל פצע דק14. כאשר הבלסטמה נוצרת בשבועות הבאים, אפידרמיס הפצע המוקדם מתפתח למבנה איתות אפיתל עבה יותר הנקרא כובע אפיתל אפיתל apical (AEC)15. בעוד עור רגיל בעובי מלא מכיל הן שכבה אפיתל והן שכבה עורית המופרדת על ידי למינה בסיסית, אפידרמיס הפצע / AEC מורכב רק משכבה אפיתל וחסר למינה בסיסית16,17. היעדר הלמינה הבסיסית והדרמיס מאפשר מגע ישיר בין תאי האפיתל של הפצע לבין הרקמות הבסיסיות, מה שמאפשר איתות דו-כיווני בין שני התאים הקריטיים הן להיווצרות הבלסטמה והן לתחזוקה17,18.
מחקרים ניסיוניים קלאסיים המציאו שיטות כירורגיות חדשניות שונות לבדיקת תפקוד אפידרמיס / AEC פצעים והכרח באמצעות עיכוב היווצרותו. שיטות אלה כללו תפירה19 או השתלת עור בעובי מלא20,21 מעל מישור הקטיעה, תפירה מיידית של הגפה הכרותה לחלל הגוף22, והסרה יומית מתמשכת או הקרנה של אפידרמיס הפצע המוקדם ו- AEC23,24. בסך הכל, ניסויים אלה לא רק ביססו את החשיבות של אפידרמיס הפצע / AEC, אלא גם קבעו עוד יותר את תפקידיו בהיסטוליזה מוקדמת של רקמות, כמו גם שמירה על התפשטות תאי האבות וצמיחת הבלסטם 13 לאורך ההתחדשות.
עם זאת, מחקרים קודמים אלה הוגבלו במידה רבה כתמים היסטולוגיים, כמו גם פולסים thymidine tritiated כדי לעקוב אחר התפשטות התא. למעשה, בחינה מחודשת של ניסויים קלאסיים אלה עם טכנולוגיות ריצוף מודרניות וטכניקות פונקציונליות בסלמנדרות נעשתה רק לאחרונה והובילה לגילוי תפקידים נוספים לאפידירמיס הפצע בהתכווצות דלקת ו- ECM השפלה / תצהיר בשלבים מוקדמים של התחדשות25. עם שחרורו של גנום סלמנדרה שונים ורצפי תמלול26,27,28,29,30,31,32,32,33,34, כמו גם המספר המתפתח של שיטות פונקציונליות הזמינות במיני סלמנדרה11,35,36,37,38 החוקרים ממוקמים כעת היטב כדי להתחיל לפענח את המנגנונים המולקולריים המניעים היווצרות אפידרמיס פצעים, פונקציה ופיתוח AEC.,
למרבה הצער, כמה מהשיטות הקלאסיות הללו המשמשות לעיכוב היווצרות אפידרמיס הפצע הן מאתגרות מבחינה טכנית, ומציגות קשיים לשחזור בין משכפלים ביולוגיים באותו ניסוי. לדוגמה, שמירה על שתלי עור יכולה להיות מאתגרת שכן שתלים עלולים בסופו של דבר ליפול מהגפה המארחת והסרת אפידרמיס הפצע / AEC מדי יום קשה מבלי לפגוע ברקמות הבסיסיות. יתר על כן, תפירת האיבר הקטוע לחלל הגוף היא מאתגרת וגם דורשת פגיעה נוספת באתר ההחדרה. מצד שני, תפירת עור בעובי מלא מיד מעל מישור הקטיעה היא פשוטה יחסית, ניתנת לשחזור מבחינה טכנית, ומציגה נזק מינימלי לרקמות. שיטה כירורגית מלאה זו של דש העור (FSF) פותחה בעבר על ידי אנתוני משר בשנת 1976 בחדשות בוגרות (Notophthalmus viridiscens). הוא הוכיח כי ניתוח FSF עיכב היווצרות אפידרמיס פצע ותפקוד על ידי איסור הן הגירת תאי אפיתל מעל מישור הקטיעה והן מגע ישיר בין תאי האפיתל לבין הרקמות הבסיסיות.
כאן, הליך כירורגי זה מוצג צעד אחר צעד באמצעות איבר axolotl. יחד עם טכנולוגיות מולקולריות ורצף מודרניות, טכניקה זו עשויה להיות מועילה מאוד לחוקרים כדי להעמיק את הבנתנו של אפידרמיס הפצע / AEC היווצרות ותפקוד במהלך התחדשות הגפיים.

<table><tbody><tr><td>Curved spring scissors</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td>Need two pairs</td></tr><tr><td>Nylon monofilament sutures (9-0)</td><td>Roboz</td><td>SUT-1000-21</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Sulfamerazine sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr></tbody></table>

inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration

ניסויים קלאסיים בביולוגיה רגנרטיבית סלמנדרה במאה האחרונה קבעו זה מכבר כי אפידרמיס הפצע הוא מבנה איתות מכריע שנוצר במהירות לאחר קטיעה ונדרש להתחדשות גפיים. עם זאת, שיטות ללמוד את תפקודו המדויק ברמה המולקולרית בעשורים האחרונים הוגבלו בשל דלות של טכניקות פונקציונליות מדויקות ומידע גנומי זמין במערכות מודל סלמנדרה. באופן מרגש, שפע טכנולוגיות הרצף האחרונות יחד עם שחרורם של גנומי סלמנדרה שונים והופעתן של שיטות בדיקה גנטיות פונקציונליות, כולל CRISPR, מאפשרות לבקר מחדש בניסויים בסיסיים אלה ברזולוציה מולקולרית חסרת תקדים. כאן, אני מתאר כיצד לבצע את ניתוח דש העור המלא שפותח באופן קלאסי (FSF) באקסולוטלים למבוגרים על מנת לעכב היווצרות אפידרמיס פצע מיד לאחר הקטיעה. האפידרמיס הפצע נוצר בדרך כלל באמצעות הגירה דיסטלית של תאי אפיתל בעור קרוב למישור הקטיעה כדי לאטום את הפצע מהסביבה החיצונית. הניתוח כרוך בתפירה מיידית של עור בעובי מלא (הכולל הן שכבות אפידרמיס והן שכבות עוריות) מעל מישור הקטיעה כדי לעכב את נדידת תאי האפיתל ומגע עם רקמות המזנכימל הפגומות שבבסיסן. ניתוחים מוצלחים גורמים לעיכוב היווצרות בלסטמה והתחדשות גפיים. על ידי שילוב של שיטת ניתוח זו עם ניתוחים מולקולריים ותפקודיים עכשוויים במורד הזרם, החוקרים יכולים להתחיל לחשוף את היסודות המולקולריים של תפקוד אפידרמיס הפצע וביולוגיה במהלך התחדשות הגפיים.

פרוטוקול כירורגי זה יאפשר עיכוב מלא של היווצרות אפידרמיס הפצע (איור 1) ובסופו של דבר, התחדשות גפיים. ניתוח מוצלח גורם ללא היווצרות blastema בכ 2-3 שבועות בהתאם לגודל של החיה, בעוד שליטה בגפיים מתחדשות צריך ליצור blastema בדרך כלל.
החוקרים צריכים לבדוק את האיבר התפור בעין בלתי כל 2-3 ימים כדי לוודא כי התפרים לא יצאו החוצה וכי blastema אינו נוצר. אם אחד או יותר מהתפרים צצים החוצה, אפידרמיס פצע עדיין יכול להיווצר וכתוצאה מכך בלסטמה קטנה או גדולה וניתוח לא מוצלח (איור 2). בנוסף, החוקרים צריכים לבדוק את האיבר התפור לפחות פעם בשבוע תחת סטריאומיקרוסקופ כדי לוודא כי אפידרמיס פצע דק לא ניכר בשום מקום על פני השטח קטוע. לשם השוואה, החוקרים צריכים גם לבחון את השליטה מתחדשת איבר אשר צריך להיות אפידרמיס פצע מעל מטוס קטיעה וליצור blastema מעל 2-3 שבועות. האפידרמיס הפצע ייראה דק וברור, בעוד העור הרגיל ייראה אטום יותר ורוד חיוור (כמעט לבן), צהוב בהיר, או ירוק כהה באקסולוטלים לאוציסטיים, לבקניים או פראיים, בהתאמה.
אם החוקרים רוצים לאסוף רקמות לפני שלבי היווצרות blastema ב 2-3 שבועות, הם צריכים לבדוק את הגפיים נתפרו לפני איסוף מדגם כדי לוודא התפרים נשארו במקום וכי אפידרמיס פצע קטן לא נוצר. בנוסף, חלוקה סגיטית דרך רקמת הגפיים התפורה וביצוע ניתוחים היסטולוגיים בכל נקודת זמן יכולים גם לאמת את נוכחותו של הדרמיס מדש העור המלא המקיף את כל מישור הקטיעה והיעדר אפידרמיס פצע (איור 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> איור 1: סכמטי של השלבים של ניתוח דש העור המלא. שלבי הפרוטוקול ממוספרים ומסומנים כאן בדיאגרמה. הקווים המקווקו מציינים את מישורי הקטיעה בשלבים 1 ו- 3 של הפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> איור 2: דוגמאות לניתוחים מוצלחים ולא מוצלחים של דש עור מלא. תמונת ברייטפילד מייצגת של איבר שעבר ניתוח מוצלח (משמאל), ניתוח לא מוצלח (מימין) וגפה מתחדשת שליטה (ללא ניתוח) ב 25 ימים לאחר כריתה (dpa). הניתוח המוצלח כולל מישור קטיעה שטוח שבו נתפר דש העור המלא, ואילו הניתוח הלא מוצלח יש blastema קטן מתפתח. ראשי חץ מציינים את מישור הקטיעה וקווים מנוקדים לבנים נמצאים שם כדי לסייע בהדמיה של היעדר בלסטמה בניתוח המוצלח ונוכחות של blastemas בניתוח לא מוצלח ושליטה על גפיים מתחדשות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> איור 3: כתמים היסטולוגיים של התחדשות רגילה וגפיים נתפרו FSF. (א-ב') תמונות ברייטפילד מייצגות של קטעים מוכתמים של פיקרו-מלורי מהתחדשות (A-A') וגפיים אקסולוטליות תפורות (B-B') ב-7 dpa. כניסות ב - A ו - B מוצגות ב - A ו - B', בהתאמה. שכבת העור הכבדה בקולגן מכסה את כל מישור הקטיעה בגפיים נתפרו. מישור קטיעה מסומן על ידי ראשי חץ ב - A-B. סרגלי קנה מידה מייצגים 500 מיקרומטר. נתון זה הותאם מ-Tsai et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration at JoVE.com

Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

מאמר זה מתאר כיצד לבצע שיטה כירורגית לעכב היווצרות אפידרמיס הפצע במהלך התחדשות הגפיים axolotl על ידי תפירת עור בעובי מלא באופן מיידי מעל מישור הקטיעה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקידים התפקודיים של אפידרמיס הפצע בשלבים המוקדמים של התחדשות הגפיים.

עיכוב של היווצרות אפידרמיס הפצע באמצעות ניתוח דש עור מלא במהלך התחדשות הגפיים Axolotl

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

inhibition-wound-epidermis-formation-via-full-skin-flap-surgery

Research

JoVE Journal

Biology

3.0K Views.  Harvard University. מאמר זה מתאר כיצד לבצע שיטה כירורגית לעכב היווצרות אפידרמיס הפצע במהלך התחדשות הגפיים axolotl על ידי תפירת עור בעובי מלא באופן מיידי מעל מישור הקטיעה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקידים התפקודיים של אפידרמיס הפצע בשלבים המוקדמים של התחדשות הגפיים.

Video: Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Developmental Biology

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) throughout life, which proliferate to reform the ependymal tube and differentiate into lost neurons after spinal cord injury. Deciphering how these NSCs retain pluripotency post-development and proliferate upon spinal cord injury to reform the exact pre-injury structure can provide valuable insight into how mammalian spinal cords may regenerate as well as potential treatment options. Performing gene knock-outs in specific subsets of NSCs within a restricted time period will allow study of the molecular mechanisms behind these regenerative processes, without being confounded by development perturbing effects. Described here is a method to perform gene knock-out in axolotl spinal cord NSCs using the CRISPR-Cas9 system. By injecting the CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation, target genes are knocked out in NSCs within specific regions of the spinal cord at a desired timepoint, allowing for molecular studies of spinal cord NSCs during regeneration.

Presented here is a protocol to perform time- and space-restricted gene knock-out in axolotl spinal cords by injecting CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation.

גן ישיר לנקוש-החוצה של חוט השדרה בתאי גזע עצביים באמצעות אלקטרופורציה של CAS9 חלבון-gRNA מכלולי

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Genetics

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as axolotls, to regenerate entire limbs as adults. Here, we outline techniques used to generate chimeric axolotls with Cas9-mutagenized haploid forelimbs that can be used for exploring gene function and the fidelity of limb regeneration. We combine several embryological and genetic techniques, including haploid generation via in vitro activation, CRISPR/Cas9 mutagenesis, and tissue grafting into one protocol to produce a unique system for haploid genetic screening in a model organism of regeneration. This strategy reduces the number of animals, space, and time required for the functional analysis of genes in limb regeneration. This also permits the investigation of regeneration-specific functions of genes that may be required for other essential processes, such as organogenesis, tissue morphogenesis, and other essential embryonic processes. The method described here is a unique platform for conducting haploid genetic screening in a vertebrate model system.

This goal of this protocol is to produce chimeric axolotls with haploid forelimbs derived from Cas9-mutagenized donor tissue using embryonic tissue grafting techniques.

הדור של כימאריק אקאוללס עם הגפיים הספאוזהות באמצעות השתלה עובריים

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.

מודל ריפוי פצעים מרין וניתוח פצעים מורפומטריים היסטולוגיים

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, ...

Apical Resection Mouse Model to Study Early Mammalian Heart Regeneration

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring cardiomyocytes lost due to injury and disease. In contrast to the robust cardiac regeneration of certain lower vertebrates, adult mammalian hearts typically show minimal capacity for heart regeneration and repair. However, recent studies have sparked considerable scientific interest with the finding that, between postnatal day 1 to 7 (P1 to P7), the neonatal mouse heart retains significant regenerative potential after apical resection (i.e., surgical amputation and exposure of left ventricular apex). One major controversy over this finding might be due to the diverse surgery-related procedures used in efforts to replicate or expand upon this important finding. These instructions dynamically present the materials and methodology for apical resection in a mouse model. The salient steps of this rodent survival surgery involve hypothermia anesthesia, thoracotomy, surgical amputation of heart ventricular apex, and suture and recovery of mice. The approach described could expand the application of the apical resection mouse model for cardiovascular research.

A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

דגם פסגת כריתת עכבר כדי ללמוד התחדשות לב יונקים מוקדמת

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring ...

Medicine

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma mexicanum). Most clinical spinal cord injuries occur as high energy blunt traumas, inducing contusion injuries. However, most studies in the axolotl spinal cord have been conducted with sharp traumas. Hence, this study aims to produce a more clinically relevant regenerative model. Due to their impressive ability to regenerate almost any tissue, axolotls are widely used as models in regenerative studies and have been used extensively in spinal cord injury (SCI) studies. In this protocol, the axolotls are anesthetized by submersion in a benzocaine solution. Under the microscope, an angular incision is made bilaterally at a level just caudal to the hind limbs. From this incision, it is possible to dissect and expose the spinous processes. Using forceps and scissors, a two-level laminectomy is performed, exposing the spinal cord. A custom trauma device consisting of a falling rod in a cylinder is constructed, and this device is used to induce a contusion injury to the spinal cord. The incisions are then sutured, and the animal recovers from anesthesia. The surgical approach is successful in exposing the spinal cord. The trauma mechanism can produce contusion injuries to the spinal cord, as confirmed by histology, MRI, and neurological examination. Finally, the spinal cord regenerates from the injury. The critical step of the protocol is removing the spinous processes without inflicting damage to the spinal cord. This step requires training to ensure a safe procedure. Furthermore, wound closure is highly dependent on not inflicting unnecessary damage to the skin during incision. The protocol was performed in a randomized study of 12 animals.

This manuscript presents protocols for surgically inflicting controlled blunt and sharp spinal cord injuries to a regenerative axolotl (Ambystoma mexicanum).

החבלה פגיעה בחוט השדרה באמצעות כריתת למינציה מיקרוכירורגית ב הרגנרציה הנרטיבית

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma ...

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. Previous research has demonstrated the regenerative ability of the heart of the adult Xenopus tropicalis, an anuran amphibian with a diploid genome and a close evolutionary relationship with mammals. Additionally, studies have shown that following ventricular apex resection, the heart can regenerate without scarring in X. tropicalis. Consequently, these previous results suggest that X. tropicalis is an appropriate alternative vertebrate model for the study of adult heart regeneration. A surgical model of cardiac regeneration in the adult X. tropicalis is presented herein. Briefly, the frogs were anesthetized and fixed; then, a small incision was made with iridectomy scissors, penetrating the skin and pericardium. Gentle pressure was applied to the ventricle, and the apex of the ventricle was then cut out with scissors. Cardiac injury and regeneration were confirmed by histology at 7-30 days post resection (dpr). This protocol established an apical resection model in adult X. tropicalis, which&#160;can be employed to elucidate the mechanisms of adult heart regeneration.

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

Xenopus tropicalis is an ideal model for regenerative research as many of its organs possess a remarkable regenerative capacity. Here, we present a method for constructing a heart injury model in X. tropicalis via apex resection.

מודל כריתה אפית בלב הבוגר Xenopus tropicalis

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

מודל מורנה של פצע צריבה שוחזר עם שתל העור Allogeneic

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

<meta charset="utf8"></head><body>שימוש בקיבוע לוחות לחקר ריפוי עצם והתחדשות גפיים באקסולוטלים

Stabilizing a Femur Osteotomy with a Plate Fixation in Ambystoma mexicanum

The axolotl (Ambystoma mexicanum) is a promising model organism for regenerative medicine due to its remarkable ability to regenerate lost or damaged organs, including limbs, brain, heart, tail, and others. Studies on axolotl shed light on cellular and molecular pathways ruling progenitor activation and tissue restoration after injury. This knowledge can be applied to facilitate the healing of regeneration-incompetent injuries, such as bone non-union. In the current protocol, the femur osteotomy stabilization using an internal plate fixation system is described. The procedure was adapted for use in aquatic animals (axolotl, Ambystoma mexicanum). &#8805;20 cm snout-to-tail tip axolotls with fully ossified, mouse-size comparable femurs were used, and special attention was paid to the plate positioning and fixation, as well as to the postoperative care. This surgical technique allows for standardized and stabilized bone fixation and could be useful for direct comparison to axolotl limb regeneration and analogous studies of bone healing across amphibians and mammals.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: חקר התחדשות באקסולוטלים באמצעות תובנות במנגנונים תאיים ומולקולריים, ריפוי עצם והשלכות על טיפולים בבני אדם

A protocol for femoral osteotomy surgery with the use of internal plate fixation in mature axolotls is presented. The procedure can be used to perform comparative studies on limb regeneration and fracture healing in aquatic amphibians.

ייצוב אוסטאוטומיה של עצם הירך עם קיבוע פלטה באמביסטומה מקסיקנית

The axolotl (Ambystoma mexicanum) is a promising model organism for regenerative medicine due to its remarkable ability to regenerate lost or damaged ...