אפיתל Mucociliary קווי איברים פנימיים של הגוף שלנו ומספק את קו ההגנה הראשון על ידי ניקוי חלקיקים זרים. פרוטוקול זה מאפשר ליצור תא עוברי נגזר אורגנואיד אפיתל ררית ב 24 שעות. היתרון העיקרי של השיטה שלנו הוא שאנחנו יכולים לפקח על ההתקדמות החיה של מעברי תאים על פני השטח של אורגנואידים.
פרוטוקול רבייה, מדרגי ומהיר זה עבור האורגנואיד המתפתח יאפשר לחוקרים לענות על שאלות בסיסיות לביולוגיה של אפיתל הררית. כדי להתחיל, להשיג X.Laevis עוברים על ידי איסוף ידני ביצים צפרדעים נקבה מגורה וביצוע הפריה חוץ גופית. דה-ג'לי העוברים המופריים בתסיסה עדינה של 2% ציסטאין, בשליש מלוחים של בארט שעבר שינוי X במשך כחמש דקות.
תרבות העוברים בשליש XMBS בטמפרטורה המועדפת עד הסימנים הראשונים של שלב 10 מזוהים, כגון המראה של תאים פיגמנטיים כהים סביב blastopore בתצוגה הצמחית. בחר ואסוף עוברים כשהם מגיעים לשלב מוקדם 10 באמצעות כלי שיער תחת סטריאוסקופ. מעבירים את העוברים שנבחרו לצלחת פטרי במילוי DFA עם פיפטה להעברה חד פעמית.
לאחר מכן להסיר את קרום vitelline של העוברים באמצעות מטלפים חדים מהצד הצמחי, מבלי לשבש את הצד החייתי של העובר. כדי לבודד את כובע החיה, מקם את הצד החייתי של העובר למעלה. ויזואלית להעריך את היקף הכובע החייתי להיות excised ולעשות את החתך הראשון לאורך הקצה עם סכין שיער, מושך את הסכין כלפי חוץ כדי להפוך את החתך.
חזור על תהליך זה כדי ליצור שרשרת של חתכים קטנים כדי למלמל את כובע החיה. חותכים את הקצה עבה השכבות של כובע החיה באמצעות סכין שיער כדי למנוע הכללה של מבשרי mesoderm. כדי להפריד בין תאי אקטודרמה עמוקים למכסה החייתי, מעבירים את כובעי החיות הממולאים לצלחת פטרי מלאה בסידן ו-DFA ללא מגנזיום עם פיפטה להעברה חד פעמית.
מקם את כובעי בעלי החיים כדי להתמודד עם צד החיה כלפי מעלה, תוך שמירה על מרחק נדיב מתפוצצים אחרים. המתן חמש עד עשר דקות ולאחר מכן נטר את המתפוצצים תחת סטריאוסקופ. לאחר שהתאים העמוקים המשוחררים שוחררו מקצה השכבה השטחית הכהה-פיגמנטית, התחילו להרים את השכבה השטחית הרחק מהתאים האפלודים העמוקים בצבעים בהירים.
ניתוק זהיר של השכבה השטחית בעזרת סכין שיער, החל מהקצה. לאחר מכן לאסוף את התאים ectoderm עמוק עם מעט סידן ומגנזיום חינם DFA ככל האפשר. העברה אספה תאי ectoderm עמוקים לצינורות PCR שאינם דבק המכילים 200 microliters של DFA בעדינות pipette התקשורת פעמיים עד שלוש פעמים כדי לפזר את התאים שהועברו.
סגור את הצינורות ולשמור אותם זקוף כדי לגרום לצבירה ספונטנית בתחתית. נטר את תהליך הצבירה תחת מיקרוסקופ סטריאו. תאים בדרך כלל מתאספים בתחתית צינור PCR בתוך שעה ולהרכיב לתוך אגרגטים כדוריים בתוך שעתיים עד שלוש שעות בהתאם לגודל.
כדי לבצע הדמיה חיה או בדיקות סמים במהלך הפיתוח של אורגנואידים אפיתל הריר, לאסוף אגרגטים ב שעתיים לאחר הצבירה באמצעות פיפיליטר 200 מצויד טיפים מוגדלים. כדי לאפשר אגרגטים להתפתח אורגנואידים אפיתל רירית בתרבות, לאסוף אותם מצינור PCR בחמש שעות לאחר הצבירה ולהעביר אותם לצלחת פטרי מלא DFA. מקם את הצבירה רחוק אחד מהשני כדי למנוע היתוך.
בתוך 24 שעות של תרבות בטמפרטורת החדר, ללא כל גורמים נוספים, אורגנואידים אפיתל ררית בוגרת ניתן לראות מסתובב בשל הסיסליה המכות המכסה את פני השטח של האפיתל הנבדל. הכינו תא הדמיה עם תחתית זכוכית על ידי הדבקת כיסוי לתא אקריליק טחון מותאם אישית עם שומן סיליקון, איטום הדוק של התא כדי למנוע דליפה של תקשורת התרבות, ולאחר מכן למלא את תא ההדמיה עם DFA. להרים מיקרוסקופ אלקטרונים שידור משושה אחד או רשת TEM באמצעות מלקחיים ולהחיל כמות זעירה של שומן על קצה הרשת.
לחץ קלות כדי לאבטח את רשת TEM לתחתית תא ההדמיה. העבר את הצבירה לתא ההדמיה והצב אותם בתוך הרשת. ממלאים את התא ב- DFA ואוטמים אותו בזכוכית כיסוי ושומן.
כדי לעקוב אחר ההתקדמות של היווצרות אורגנואיד אפיתל ריר, לאסוף תמונות z-מחסנית זמן פקע של אגרגטים באמצעות מיקרוסקופ confocal. אורגנואידים אפיתל Mucociliary נוצרו מאבי קדמונים רב תכליתיים של עוברי שלב גסטרולה מוקדם X.Laevis. האורגנואידים יש אפידרמיס בוגר כי הוא נבדל מזה של ראשן כולל אפיתל מובחן לחלוטין, ריר הפרשת תאי גביע, תאים multiciliated ותאי הפרשה קטנים.
הדינמיקה של התפתחות האורגנואידים לוותה בהדמיה חיה. כדי לבחון את האפיתליזציה העולה בשלב מוקדם של היווצרות האורגנואידים, העוברים תויגו בחלבוני צומת הדוקים ומתויגים באופן פלואורסצנטי וחלבונים לוקליזציה של קרום. עם תיוג כפול השלבים הרציף של היווצרות צומת הדוק ZO-1 חיובי ניתן לסמן ולנתח כמותית במהלך אפיתליזציה.
אזורים מסוימים של הידבקות תא תאים יש פנצטה מפוזרת של ZO-1 בשלבים שונים של אפיתליזציה. לעומת זאת, אזורים אחרים הרכיבו באופן מלא ביטוי ZO-1 רציף. עם הזמן הנקבה מתמזגת ומתחברת ויוצרת צמתים הדוקים רציפים, אשר שומרים על המורפולוגיה שלהם גם במהלך חלוקת התאים.
ככל שהצומתים ההדוקים מתבגרים, התאים נעים באופן דינמי פנימה ומחוץ לפני השטח לאורך המישורים האפוריים של האורגנואידים. ניתוח רב-קנה מידה אפשרי על ידי מעקב אחר תאים מרחביים-זמניים על פני השטח של אורגנואידים מפרידים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור לשים את הצד הכהה-פיגמנט של כובע החיה לבודד פונה כלפי מעלה ולנטר אותו תחת סטריאוסקופ.
זה קריטי כדי להפריד את השכבה השטחית של כובע החיה בתזמון הנכון בתקשורת DFA ללא סידן / מגנזיום. פרוטוקול פשוט זה מציע דרכים שימושיות ללמוד התנהגויות תאים דינמיות, כמו גם את המנגנונים המולקולריים והפיזיים המסדירים אפיתל ררית.
