O epitélio mucociliário alinha órgãos internos do nosso corpo e fornece a primeira linha de defesa limpando partículas estranhas. Este protocolo permite gerar organoide epitelial mucociliary derivado de células embrionárias em 24 horas. A principal vantagem do nosso método é que podemos monitorar a progressão viva das transições celulares na superfície dos organoides.
Este protocolo reprodutível, escalável e rápido para o organoide em desenvolvimento permitirá que os pesquisadores abdoem questões fundamentais para a biologia do epitélio mucociliary. Para começar, obtenha embriões X.Laevis coletando manualmente ovos de sapos fêmeas estimuladas e realizando fertilização in vitro. Desgarra os embriões fertilizados com agitação suave em 2%, em um terço salina de Barth modificada x por cerca de cinco minutos.
Cultura os embriões em um terço XMBS na temperatura preferida até que os primeiros sinais do estágio 10 sejam detectados, como o aparecimento de células pigmentadas escuras ao redor do blastopore na vista vegetal. Selecione e reúna embriões à medida que chegam ao estágio inicial 10 usando ferramentas capilares sob um estereoscópio. Transfira os embriões selecionados para uma placa de Petri recheada de DFA com uma pipeta de transferência descartável.
Em seguida, remova a membrana vitelline dos embriões usando fórceps afiados do lado vegetal, sem interromper o lado animal do embrião. Para isolar a tampa animal, posicione o lado animal do embrião para cima. Premente visualmente a extensão da tampa animal a ser extirpada e faça a primeira incisão ao longo da borda com uma faca de cabelo, puxando a faca para fora para fazer o corte.
Repita este processo para criar uma cadeia de pequenos cortes para extirpar a tampa animal. Apare a borda grossa da tampa animal usando uma faca de cabelo para evitar a inclusão de precursores de mesoderm. Para separar as células de ectoderme profundo da tampa animal, transfira as tampas de animais excisadas para uma placa de Petri cheia de DFA sem cálcio e magnésio com uma pipeta de transferência descartável.
Posicione as tampas dos animais para enfrentar o lado animal para cima, mantendo uma distância generosa de outras explantas. Espere de cinco a dez minutos, e depois monitore as explants sob um estereóscópio. Uma vez que as células profundas soltas tenham sido liberadas da borda da camada superficial pigmentada escura, comece a levantar a camada superficial para longe das células de ectoderme profundo de cor clara.
Desprende cuidadosamente a camada superficial com uma faca de cabelo, começando na borda. Em seguida, colete as células de ectoderme profundo com o mínimo de cálcio e DFA livre de magnésio possível. Transfira células de ectoderme profundas coletadas para tubos PCR não adesivos contendo 200 microliters de DFA e pipeta suavemente a mídia duas a três vezes para dispersar as células transferidas.
Feche os tubos e mantenha-os eretos para induzir a agregação espontânea na parte inferior. Monitore o processo de agregação sob um microscópio estéreo. As células normalmente se reúnem na parte inferior do tubo PCR dentro de uma hora e se reúnem em agregados esféricos dentro de duas a três horas, dependendo do tamanho.
Para realizar imagens ao vivo ou testes de drogas durante o desenvolvimento dos organoides epiteliais mucociliares, colete agregados em duas horas após a agregação usando uma pipeta de 200 microliteres equipada com pontas ampliadas. Para permitir que os agregados se desenvolvam em organoides epiteliais mucociliais na cultura, colete-os do tubo PCR em cinco horas após a agregação e transfira-os para uma placa de Petri preenchida com DFA. Posicione os agregados distantes um do outro para evitar fusão.
Dentro de 24 horas de cultura à temperatura ambiente, sem quaisquer fatores adicionados, organoides epiteliais mucociliais maduros podem ser observados girando devido à batida cilia que cobre a superfície do epitélio diferenciado. Prepare uma câmara de imagem de fundo de vidro colando um vidro de cobertura a uma câmara de acrílico personalizada com graxa de silicone, selando firmemente a câmara para evitar vazamentos da mídia cultural, em seguida, encha a câmara de imagem com DFA. Pegue uma microscopia eletrônica de transmissão hexagonal ou grade TEM usando fórceps e aplique uma pequena quantidade de graxa na borda da grade.
Pressione levemente para baixo para fixar a grade TEM na parte inferior da câmara de imagem. Transfira os agregados para a câmara de imagem e posicione-os dentro da grade. Encha a câmara com DFA e sele-a com um copo de cobertura e graxa.
Para acompanhar a progressão da formação organoide epitelial mucociliary, colete imagens de z-stack de agregados com lapso de tempo usando um microscópio confocal. Organoides epiteliais mucociliais foram gerados a partir de progenitores multipotentes dos embriões x.laevis estágio x.laevis precoce. Os organoides têm uma epiderme madura que é indistinguível da de um girino, incluindo um epitélio totalmente diferenciado, células cálices secretas, células multiciliárias e pequenas células secretas.
A dinâmica do desenvolvimento organoide foi seguida por imagens ao vivo. Para examinar a epitelialização que emerge no estágio inicial da formação organoide, os embriões foram rotulados com proteínas de junção apertadas marcadas fluorescente e proteínas de localização de membrana. Com a rotulagem dupla, as etapas sequenciais da formação de junção apertada positiva zo-1 podem ser marcadas e quantitativamente analisadas durante a epitelialização.
Algumas regiões de adesão celular têm espalhado puncta do ZO-1 em diferentes estágios de epitelialização. Em contraste, outras áreas montaram totalmente a expressão ZO-1 contígua. Com o tempo, o puncta coalesce e se conecta para formar junções apertadas contíguas, que mantêm sua morfologia mesmo durante a divisão celular.
À medida que as junções apertadas amadurecem, as células se movem dinamicamente para dentro e para fora da superfície ao longo dos planos apical dos organoides. A análise em várias escalas é possível rastreando células espátulas na superfície dos organoides diferenciadores. Ao tentar este protocolo, lembre-se de colocar o lado pigmentado escuro da tampa animal isolada virada para cima e monitorá-lo sob um estereóscópio.
É fundamental separar a camada superficial da tampa animal no momento certo na mídia DFA livre de cálcio/magnésio. Este protocolo simples oferece maneiras úteis de estudar comportamentos celulares dinâmicos, bem como os mecanismos moleculares e físicos que regulam o epitélio mucociliary.
