Mucociliary epitel vücudumuzun iç organları hatları ve yabancı parçacıkları temizleyerek savunma ilk satırı sağlar. Bu protokol, 24 saat içinde embriyonik hücre türetilmiş mukozi epitel organoidi üretmeyi mümkün kılmıştır. Yöntemimizin en önemli avantajı, organoidlerin yüzeyinde hücre geçişlerinin canlı ilerlemesini izleyebiliyor olmamızdır.
Gelişmekte olan organoid için bu tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve hızlı protokol araştırmacılar mucociliary epitel biyolojisi için temel soruları ele sağlayacaktır. Başlamak için, elle uyarılmış dişi kurbağayumurta ları toplayarak ve in vitro fertilizasyon gerçekleştirerek X.Laevis embriyoları elde. De-jöle% 2 sistein nazik ajitasyon ile döllenmiş embriyolar, üçte biri X-modifiye Barth's tuzlu yaklaşık beş dakika.
Kültür embriyolar tercih edilen sıcaklıkta üçte bir XMBS evre 10 ilk işaretleri tespit kadar, bitki görünümünde blastopore etrafında koyu pigmentli hücrelerin görünümü gibi. Bir stereoskop altında saç aletleri kullanarak erken evre 10 ulaşmak gibi embriyoseçin ve toplamak. Seçilen embriyoları tek kullanımlık transfer pipetiyle DFA dolu bir Petri kabına aktarın.
Daha sonra embriyonun hayvan tarafını bozmadan, bitkisel taraftan keskin forceps kullanarak embriyoların vitellin membran kaldırın. Hayvan kapağını izole etmek için, embriyonun hayvan tarafını yukarı doğru konumlandırın. Hayvan kapağının ne ölçüde eksizyonu olduğunu görsel olarak tahmin edin ve bir saç bıçağıyla kenar boyunca ilk kesiyi yapın, bıçağı kesip dışarı doğru çekerek.
Hayvan kapağını çıkarmak için küçük kesikler zinciri oluşturmak için bu işlemi tekrarlayın. Mezoderm öncülerinin eklenmesini önlemek için hayvan kapağının kalın katmanlı kenarını bir saç bıçağı kullanarak kırpın. Derin ektoderm hücrelerini hayvan başlığından ayırmak için, eksinti hayvan kapaklarını tek kullanımlık transfer pipetiyle kalsiyum ve magnezyumsuz DFA ile dolu bir Petri kabına aktarın.
Hayvan kapaklarını hayvan tarafına doğru konumlandırın, diğer ekstesilerden cömert bir mesafe yitin. 5-10 dakika bekleyin ve sonra bir stereoskop altında eksefors izleyin. Gevşetilmiş derin hücreler koyu pigmentli yüzeysel tabakanın kenarından serbest bırakıldıktan sonra, yüzeysel katmanı açık renkli derin ektoderm hücrelerinden uzaklaştırmaya başlar.
Dikkatle kenarından başlayan bir saç bıçağı ile yüzeysel tabaka ayırmak. Sonra mümkün olduğunca az kalsiyum ve magnezyum içermeyen DFA ile derin ektoderm hücreleri toplamak. Toplanan derin ektoderm hücrelerini 200 mikrolitre DFA içeren yapışkan olmayan PCR tüplere aktarın ve aktarılan hücreleri dağıtmak için ortama 2-3 kez pipet atın.
Tüpleri kapatın ve altta spontan toplama neden onları dik tutun. Stereo mikroskop altında toplama işlemini izleyin. Hücreler genellikle bir saat içinde PCR tüpünün alt kısmında toplanır ve boyutuna bağlı olarak iki ila üç saat içinde küresel agregalar halinde toplanır.
Mucociliary epitel organoidlerin gelişimi sırasında canlı görüntüleme veya uyuşturucu testi yapmak için, genişlemiş ipuçları ile donatılmış 200 mikrolitrelik pipet kullanarak iki saat sonra agrega toplamak. Agregaların kültürde mukozier epitel organoidlere dönüşmesine izin vermek için, bunları toplama dan sonra beş saat içinde PCR tüpünden toplayın ve DFA dolu petri kabına aktarın. Erimeyi önlemek için agregaları birbirinden uzak konumlandırın.
Oda sıcaklığında kültür 24 saat içinde, herhangi bir ek faktör olmadan, olgun mukozi epitel organoidler farklılaşmış epitel yüzeyini kaplayan dayak silya nedeniyle dönen görülebilir. Bir kapak bardağını silikon gresli özel bir frezeli akrilik hazneye yapıştırarak, kültür ortamının sızmasını önlemek için hazneyi sıkıca mühürleyerek cam alttan bir görüntüleme odası hazırlayın, ardından görüntüleme odasını DFA ile doldurun. Bir altıgen iletim elektron mikroskobu veya TEM ızgara forceps kullanarak almak ve ızgara kenarına yağ küçük bir miktar uygulayın.
TEM ızgarasını görüntüleme odasının altına sabitlemek için hafifçe bastırın. Agregaları görüntüleme odasına aktarın ve ızgara içinde yerleştirin. DFA ile oda doldurun ve bir kapak cam ve gres ile mühür.
Mukoziyal epitel organoid oluşumunun ilerlemesini takip etmek için, konfokal mikroskop kullanarak agregaların zaman zaman geçmiş z-yığın görüntülerini toplamak. Erken gastrula evre X.Laevis embriyolarının çok güçlü atalarından mucocilier epitel organoidler üretildi. Organoidler tam farklılaşmış epitel, mukus salgılayan goblet hücreleri, çok katlı hücreler ve küçük salgı hücreleri de dahil olmak üzere bir kurbağa yavrusu nun ayırt edilemez olgun bir epidermis var.
Organoid gelişimdinamiklerini canlı görüntüleme izledi. Organoid oluşumunun erken evresinde ortaya çıkan epitelizasyonu incelemek için embriyolar floresan etiketli sıkı kavşak proteinleri ve membran lokalize proteinler ile etiketlendi. Çift etiketleme ile ZO-1 pozitif sıkı kavşak oluşumunun sıralı basamakları epitelizasyon sırasında işaretlenebilir ve nicel olarak analiz edilebilir.
Hücre-hücre adezyonunun bazı bölgeleri epitelizasyonun farklı aşamalarında ZO-1 puncta'sını dağıtmıştır. Buna karşılık, diğer alanlarda tam bitişik ZO-1 ifade monte var. Zamanla puncta birleşir ve hücre bölünmesi sırasında bile morfolojilerini koruyan bitişik sıkı kavşaklar oluşturur.
Sıkı kavşaklar olgunlaştıkça, hücreler organoidlerin apikal düzlemleri boyunca dinamik olarak yüzeye girip çıkarlar. Çok ölçekli analiz, farklıorganoidlerin yüzeyindeki hücreleri spatio-temporal olarak izleyerek mümkündür. Bu protokolü denerken, izole hayvan kapağının koyu pigmentli tarafını yukarı yaslayıp stereoskop altında izlemeyi unutmayın.
Kalsiyum/magnezyum içermeyen DFA ortamlarında hayvan kapağının yüzeysel tabakasını doğru zamanlamada ayırmak çok önemlidir. Bu basit protokol, mukozisel epiteli düzenleyen moleküler ve fiziksel mekanizmaların yanı sıra dinamik hücre davranışlarını incelemek için kullanışlı yollar sunar.
