Мукоцилиарный эпителий линий внутренних органов нашего тела и обеспечивает первую линию обороны путем очистки иностранных частиц. Этот протокол позволяет генерировать эмбриональные клетки, полученные слизистой оболочки эпителиального органоида в течение 24 часов. Ключевым преимуществом нашего метода является то, что мы можем контролировать живое прогрессирование клеточных переходов на поверхности органоидов.
Этот воспроизводимый, масштабируемый и быстрый протокол для развивающегося органоида позволит исследователям решать фундаментальные вопросы для биологии слизистой эпителия. Для начала получите эмбрионы X.Laevis, вручную собирая яйцеклетки у стимулируемых самок лягушек и выполняя экстракорпоральное оплодотворение. Де-желе оплодотворенных эмбрионов с нежным возбуждением в 2%cysteine, в одной трети X-модифицированных солевой Барта в течение примерно пяти минут.
Культура эмбрионов в одной трети XMBS при предпочтительной температуре до тех пор, пока первые признаки стадии 10 обнаружены, такие как появление темных пигментированных клеток вокруг блатопора на вегетативной зрения. Выберите и соберите эмбрионы по мере их достижения на ранней стадии 10 с помощью инструментов для волос под стереоскопом. Перенесите отобранные эмбрионы в заполненную DFA чашку Петри с одноразовой трубкой для переноски.
Затем удалите вителлиновую мембрану эмбрионов с помощью острых типсов с вегетативной стороны, не нарушая сторону эмбриона. Чтобы изолировать крышку животного, распоить животную сторону эмбриона вверх. Визуально оценить степень животного крышка будет вырезана и сделать первый разрез вдоль края с ножом для волос, потянув нож наружу, чтобы сделать разрез.
Повторите этот процесс, чтобы создать цепочку небольших сокращений, чтобы акцизную крышку животного. Обрезать толстый слой края крышки животного с помощью ножа для волос, чтобы предотвратить включение мезодерм прекурсоров. Чтобы отделить глубокие эктодермальные клетки от крышки животного, перенесите вырезанные колпачки животных в чашку Петри, наполненную кальцием и магнием DFA с одноразовой трубкой передачи.
Распоистите крышки животного лицом вверх, сохраняя щедрое расстояние от других эксплантов. Подождите пять-десять минут, а затем следите за эксплантами под стереоскопом. После того, как ослабленные глубокие клетки были освобождены от края темного пигментного поверхностного слоя, начните поднимать поверхностный слой от светлых глубоких эктодермальных клеток.
Аккуратно отсоедините поверхностный слой ножом для волос, начиная с края. Затем соберите глубокие клетки эктодерма с как можно меньше кальция и магния DFA, как это возможно. Передача собранных глубоких эктодермальных клеток в неклейвые ПЦР трубки, содержащие 200 микролитров DFA и аккуратно пипетки средств массовой информации два-три раза, чтобы разогнать переданные клетки.
Закройте трубки и держите их в вертикальном положении, чтобы вызвать спонтанную агрегацию в нижней части. Мониторинг процесса агрегации под стерео микроскопом. Клетки обычно собираются в нижней части трубки ПЦР в течение часа и собираются в сферические агрегаты в течение двух-трех часов в зависимости от размера.
Для проведения живой визуализации или тестирования на наркотики во время разработки мукокоцилиальных эпителиальных органоидов, собирать агрегаты в течение двух часов после агрегации с помощью 200 микролитров пипетки оснащены увеличенными кончиками. Чтобы агрегаты превратились в слизистые эпителиальные органоиды в культуре, соберите их из трубки ПЦР в течение пяти часов после агрегации и перенесите их в заполненную DFA чашку Петри. Распоить агрегаты далеко друг от друга, чтобы предотвратить слияние.
В течение 24 часов культуры при комнатной температуре, без каких-либо дополнительных факторов, зрелые слизистые эпителиальные органоиды могут наблюдаться вращающиеся из-за избиения ресничок, который покрывает поверхность дифференцированного эпителия. Подготовьте стеклянную нижнюю камеру визуализации, приклеив крышку стекла к изготовленной на заказ акриловой камере с кремниевой смазкой, плотно запечатав камеру, чтобы предотвратить утечку культурных средств массовой информации, а затем заполните камеру визуализации DFA. Возьмите одну шестиугольную электронную микроскопию передачи или сетку TEM с помощью типсов и нанесите небольшое количество жира на край сетки.
Нажмите вниз слегка, чтобы обеспечить сетку TEM в нижней части камеры изображения. Перенесите агрегаты в камеру визуализации и распоите их в сетке. Заполните камеру DFA и запечатать его крышкой стекла и жира.
Чтобы следить за прогрессированием слизистой оболочки эпителиального органоидного образования, собирайте снимки агрегатов с помощью конфокального микроскопа. Мукоцилиальные эпителиальные органоиды были получены из мультипотентных прародителей ранних гаструловой стадии X.Laevis эмбрионов. Органоиды имеют зрелый эпидермис, который неотличим от головастика, включая полностью дифференцированный эпителий, слизь, секретая клетки кубок, многоцилиотические клетки и небольшие секреторные клетки.
За динамикой развития органоидов последовала живая визуализация. Для изучения эпителиализации, которая возникает на ранней стадии органоидного образования, эмбрионы были помечены флуоресцентно помечены плотные белки соединения и мембраны локализации белков. При двойной маркировке последовательные шаги положительного плотного образования соединения ЗО-1 могут быть отмечены и количественно проанализированы во время эпителиализации.
Некоторые области клеточной адгезии рассеяли панкту ЗО-1 на разных стадиях эпителиализации. В отличие от этого, в других областях полностью собрано сопредельное выражение ЗО-1. Со временем панкта сливаются и соединяются, чтобы сформировать смежные плотные соединения, которые поддерживают их морфологию даже во время деления клеток.
По мере того как плотные соединения зреют, клетки динамически двигают внутри и из поверхности вдоль apical плоскостей organoids. Многомасштабный анализ возможен путем отслеживания клеток spatio-temporally на поверхности дифференцируя органоидов. При попытке этого протокола, не забудьте положить темно-пигментированной стороне изоляции животных крышка лицом вверх и контролировать его под стереоскоп.
Очень важно отделить поверхностный слой крышки животного в нужное время в кальция / магния свободных DFA средств массовой информации. Этот простой протокол предлагает удобные способы изучения динамического поведения клеток, а также молекулярных и физических механизмов, регулирующих слизистую эпителий.
