L’épithélium mucociliaire tapisse les organes internes de notre corps et fournit la première ligne de défense en dégageant les particules étrangères. Ce protocole permet de générer des organoïdes épithéliales épithéliales dérivés de cellules embryonnaires en 24 heures. Le principal avantage de notre méthode est que nous pouvons surveiller la progression en direct des transitions cellulaires à la surface des organoïdes.
Ce protocole reproductible, évolutif et rapide pour l’organoïde en développement permettra aux chercheurs d’aborder des questions fondamentales pour la biologie de l’épithélium mucociliaire. Pour commencer, obtenir des embryons X.Laevis en recueillant manuellement des ovules de grenouilles femelles stimulées et en effectuant une fécondation in vitro. Dé-gelée les embryons fécondés avec agitation douce dans 2% cystéine, dans un tiers X-modifié Barth salin pendant environ cinq minutes.
Culture des embryons dans un tiers XMBS à la température préférée jusqu’à ce que les premiers signes de l’étape 10 sont détectés, tels que l’apparition de cellules pigmentées foncées autour du blastopore à la vue végétale. Sélectionnez et rassemblez des embryons lorsqu’ils atteignent le stade 10 précoce à l’aide d’outils capillaux sous stéréoscope. Transférer les embryons sélectionnés dans une boîte de Pétri remplie de DFA avec une pipette de transfert jetable.
Retirez ensuite la membrane vitelline des embryons à l’aide de forceps tranchants du côté végétal, sans perturber le côté animal de l’embryon. Pour isoler le capuchon animal, placez le côté animal de l’embryon vers le haut. Estimer visuellement l’étendue du bouchon animal à exciser et faire la première incision le long du bord avec un couteau à cheveux, en tirant le couteau vers l’extérieur pour faire la coupe.
Répétez ce processus pour créer une chaîne de petites coupures pour exciser le bouchon animal. Coupez le bord épais du capuchon animal à l’aide d’un couteau à cheveux pour empêcher l’inclusion de précurseurs mésoderm. Pour séparer les cellules profondes de l’ectoderm du capuchon animal, transférez les bouchons d’animaux excisés dans une boîte de Pétri remplie de calcium et de DFA sans magnésium avec une pipette de transfert jetable.
Placez les bouchons d’animaux pour faire face au côté animal vers le haut, en maintenant une distance généreuse par rapport aux autres explants. Attendez cinq à dix minutes, puis surveillez les explants sous un stéréoscope. Une fois que les cellules profondes desserrées ont été libérées du bord de la couche superficielle pigmentée par l’obscurité, commencez à soulever la couche superficielle loin des cellules ectoderm profondes de couleur claire.
Détachez soigneusement la couche superficielle à l’aide d’un couteau à cheveux, à partir du bord. Puis recueillir les cellules ectoderm profondes avec le moins de calcium et de magnésium sans DFA que possible. Transfert recueilli cellules ectoderm profondes à des tubes PCR non adhésifs contenant 200 microlitres de DFA et doucement pipette les médias deux à trois fois pour disperser les cellules transférées.
Fermez les tubes et maintenez-les droits pour induire une agrégation spontanée au fond. Surveillez le processus d’agrégation au microscope stéréo. Les cellules se rassemblent généralement au bas du tube PCR en moins d’une heure et s’assemblent en agrégats sphériques dans les deux à trois heures selon la taille.
Pour effectuer des tests d’imagerie en direct ou de dépistage de drogues pendant le développement des organoïdes épithéliales mucociliaires, recueillez les agrégats à deux heures après l’agrégation à l’aide d’une pipette de 200 microlitres munie de pointes agrandies. Pour permettre aux agrégats de se développer en organoïdes épithéliales mucociliaires en culture, recueillez-les dans le tube PCR à cinq heures après l’agrégation et transférez-les dans une boîte de Pétri remplie de DFA. Placez les agrégats loin les uns des autres pour éviter la fusion.
Dans les 24 heures de culture à température ambiante, sans aucun facteur supplémentaire, des organoïdes épithéliales mucociliaires matures peuvent être observés tournant en raison des cils battants qui recouvrent la surface de l’épithélium différencié. Préparer une chambre d’imagerie à fond de verre en collant un verre de couverture dans une chambre acrylique moulue sur mesure avec de la graisse de silicium, en scellant hermétiquement la chambre pour éviter les fuites des supports de culture, puis remplissez la chambre d’imagerie avec du DFA. Ramassez une microscopie électronique hexagonale ou une grille TEM à l’aide de forceps et appliquez une petite quantité de graisse sur le bord de la grille.
Appuyez légèrement pour fixer la grille TEM au fond de la chambre d’imagerie. Transférez les agrégats à la chambre d’imagerie et placez-les dans la grille. Remplissez la chambre de DFA et scellez-la avec un verre de couverture et de la graisse.
Pour suivre la progression de la formation organoïde épithéliale mucociliaire, recueillez des images z-stack périmées d’agrégats à l’aide d’un microscope confocal. Des organoïdes épithéliales mucociliaires ont été générés à partir d’progéniteurs multipotents d’embryons X.Laevis au stade gastrula précoce. Les organoïdes ont un épiderme mature qui est indiscernable de celui d’un têtard comprenant un épithélium entièrement différencié, des cellules de gobelet sécrétant le mucus, des cellules multiciliées et de petites cellules sécréteurs.
La dynamique du développement organoïde a été suivie par l’imagerie vivante. Pour examiner l’épithélialisation qui émerge au stade précoce de la formation organoïde, les embryons ont été étiquetés avec des protéines de jonction serrées étiquetées fluorescentement et des protéines de localisation des membranes. Avec l’étiquetage double, les étapes séquentielles de la formation positive de jonction serrée ZO-1 peuvent être marquées et quantitativement analysées pendant l’épithélialisation.
Certaines régions de l’adhérence cellule-cellule ont dispersé la ponction de ZO-1 à différents stades de l’épithélialisation. En revanche, d’autres domaines ont entièrement assemblé l’expression contiguë ZO-1. Au fil du temps, la ponction se combine et se connecte pour former des jonctions étroites contiguës, qui maintiennent leur morphologie même pendant la division cellulaire.
À mesure que les jonctions serrées mûrissent, les cellules se déplacent dynamiquement à l’extérieur et à l’extérieur de la surface le long des plans apical des organoïdes. L’analyse à plusieurs échelles est possible en suivant les cellules spatio-temporellement à la surface des organoïdes différeciants. Lorsque vous essayez ce protocole, n’oubliez pas de mettre le côté pigmenté foncé de la calotte animale isoler face vers le haut et le surveiller sous un stéréoscope.
Il est essentiel de séparer la couche superficielle de la calotte animale au bon moment dans les supports sans calcium/magnésium DFA. Ce protocole simple offre des moyens pratiques d’étudier les comportements cellulaires dynamiques ainsi que les mécanismes moléculaires et physiques régulant l’épithélium mucociliaire.
