El epitelio mucociliar recuica los órganos internos de nuestro cuerpo y proporciona la primera línea de defensa al eliminar partículas extrañas. Este protocolo permite generar organoide epitelial mucociliar derivado de células embrionarias en 24 horas. La ventaja clave de nuestro método es que podemos monitorear la progresión en vivo de las transiciones celulares en la superficie de los organoides.
Este protocolo reproducible, escalable y rápido para el organoide en desarrollo permitirá a los investigadores abordar cuestiones fundamentales para la biología del epitelio mucociliar. Para empezar, obtener embriones X.Laevis mediante la recolección manual de óvulos de ranas hembra estimuladas y la realización de fertilización in vitro. Des-jalea los embriones fertilizados con agitación suave en 2%cisteína, en un tercio X-modificado solución salina de Barth durante unos cinco minutos.
Cultivo de los embriones en un tercio XMBS a la temperatura preferida hasta que se detecten los primeros signos de la etapa 10, como la aparición de células pigmentadas oscuras alrededor del blastoreo a la vista vegetal. Seleccione y recoja embriones a medida que alcanzan la etapa temprana 10 utilizando herramientas para el cabello bajo un estereoscopio. Transfiera los embriones seleccionados a un plato Petri lleno de DFA con una pipeta de transferencia desechable.
A continuación, retire la membrana vitellina de los embriones utilizando fórceps afilados del lado vegetal, sin interrumpir el lado animal del embrión. Para aislar la tapa del animal, coloque el lado animal del embrión hacia arriba. Estimar visualmente la extensión de la tapa del animal que se va a extirpar y hacer la primera incisión a lo largo del borde con un cuchillo de pelo, tirando del cuchillo hacia afuera para hacer el corte.
Repita este proceso para crear una cadena de pequeños cortes para extirpar la tapa del animal. Recortar el borde de capa gruesa de la tapa del animal utilizando un cuchillo para el pelo para evitar la inclusión de precursores de mesodermo. Para separar las células profundas del ectodermo de la tapa del animal, transfiera las tapas de animales extirpadas a un plato de Petri lleno de DFA sin calcio y magnesio con una pipeta de transferencia desechable.
Coloque las tapas de los animales para mirar hacia arriba, manteniendo una distancia generosa de otros explantes. Espere de cinco a diez minutos y, a continuación, monitoree los explants debajo de un estereoscopio. Una vez que las células profundas aflojadas se han liberado del borde de la capa superficial pigmentada oscura, comienza a levantar la capa superficial lejos de las células de ectodermo profundo de color claro.
Separe cuidadosamente la capa superficial con un cuchillo para el cabello, comenzando en el borde. A continuación, recoger las células de ectodermo profundo con el menor calcio y DFA libre de magnesio como sea posible. Transfiera las células de ectodermo profundo recogidas a tubos de PCR no adhesivos que contengan 200 microlitros de DFA y pipetee suavemente los medios dos o tres veces para dispersar las células transferidas.
Cierre los tubos y manténgalos en posición vertical para inducir la agregación espontánea en la parte inferior. Supervise el proceso de agregación bajo un microscopio estéreo. Las células normalmente se reúnen en la parte inferior del tubo pcR dentro de una hora y se ensamblan en agregados esféricos dentro de dos a tres horas dependiendo del tamaño.
Para realizar imágenes en vivo o pruebas de drogas durante el desarrollo de los organoides epiteliales mucociliares, recoja los agregados a las dos horas después de la agregación utilizando una pipeta de 200 microlitros equipada con puntas agrandadas. Para permitir que los agregados se conviertan en organoides epiteliales mucociliares en el cultivo, recóralos del tubo de PCR a las cinco horas después de la agregación y transfieralos a un plato Petri lleno de DFA. Coloque los agregados muy separados entre sí para evitar fusiones.
Dentro de las 24 horas de cultivo a temperatura ambiente, sin ningún factor añadido, se pueden observar organoides epiteliales mucociliar maduros girando debido a la paliza de los cilios que cubre la superficie del epitelio diferenciado. Prepare una cámara de imágenes con fondo de vidrio pegando un vidrio de cubierta a una cámara de acrílico fresada a medida con grasa de silicio, sellando firmemente la cámara para evitar fugas de los medios de cultivo y, a continuación, llene la cámara de imágenes con DFA. Recoge una microscopía electrónica de transmisión hexagonal o una rejilla TEM usando fórceps y aplica una pequeña cantidad de grasa al borde de la red.
Presione ligeramente hacia abajo para fijar la rejilla TEM a la parte inferior de la cámara de imágenes. Transfiera los agregados a la cámara de imágenes y colóquelos dentro de la cuadrícula. Llene la cámara con DFA y ciélela con un vaso de cubierta y grasa.
Para seguir la progresión de la formación de organoides epiteliales mucociliares, recopile imágenes de agregados de agregados con lapsos de tiempo transcurridos por tiempo utilizando un microscopio confocal. Los organoides epiteliales mucociliares se generaron a partir de progenitores multipotentes de embriones X.Laevis en etapa de gastrula temprana. Los organoides tienen una epidermis madura que es indistinguible de la de un renacuajo incluyendo un epitelio totalmente diferenciado, células de la copa secretoras de moco, células multiciliadas y pequeñas células secretoras.
La dinámica del desarrollo organoides fue seguida por imágenes en vivo. Para examinar la epitelización que surge en la etapa temprana de la formación de organoides, los embriones fueron etiquetados con proteínas de unión apretadas etiquetadas fluorescentemente y proteínas localizadoras de membrana. Con el etiquetado doble, los pasos secuenciales de la formación de unión estrecha positiva ZO-1 se pueden marcar y analizar cuantitativamente durante la epitelización.
Algunas regiones de adhesión de células celulares han dispersado puncta de ZO-1 en diferentes etapas de la epitelización. Por el contrario, otras áreas han ensamblado completamente la expresión ZO-1 contigua. Con el tiempo, la puncta se une y se conecta para formar uniones estrechas contiguas, que mantienen su morfología incluso durante la división celular.
A medida que las uniones estrechas maduran, las células se mueven dinámicamente dentro y fuera de la superficie a lo largo de los planos apicales de los organoides. El análisis a varias escalas es posible mediante el seguimiento de células espacio-temporalmente en la superficie de organoides diferenciadores. Al intentar este protocolo, recuerde colocar el lado pigmentado oscuro de la tapa del animal aislado mirando hacia arriba y monitorearlo debajo de un estereoscopio.
Es fundamental separar la capa superficial de la tapa del animal en el momento adecuado en medios DFA libres de calcio/magnesio. Este sencillo protocolo ofrece formas prácticas de estudiar los comportamientos celulares dinámicos, así como los mecanismos moleculares y físicos que regulan el epitelio mucociliar.
