점액 상피는 우리 몸의 내부 장기를 선적하고 이물질 입자를 제거하여 방어의 첫 번째 라인을 제공합니다. 이 프로토콜은 24시간 안에 배아 세포 유래 점액 상피 오르간로이드를 생성할 수 있게 한다. 우리의 방법의 주요 장점은 우리가 오르가노이드의 표면에 세포 전환의 살아있는 진행을 모니터링 할 수 있다는 것입니다.
개발 오르가노이드에 대한 이 재현 가능하고 확장 가능하며 신속한 프로토콜은 연구원이 점막 상피의 생물학에 대한 근본적인 질문을 해결할 수 있게 합니다. 시작하려면 자극된 여성 개구리로부터 계란을 수동으로 수집하고 체외 수정을 수행하여 X.Laevis 배아를 얻습니다. 2%시스테인에서 부드러운 동요를 가진 수정된 배아를 약 5분 동안 X 변형 바스의 식염수로 분해합니다.
10단계의 첫 징후가 검출될 때까지 바람직한 온도에서 1/3 XMBS에서 배아를 배양하는 것은 식물의 전광도 주위의 어두운 색소 세포의 출현과 같은 이다. 입체로 모발 도구를 사용하여 10단계 초반에 도달할 때 배아를 선택하고 수집합니다. 선택한 배아를 일회용 이송 파이펫으로 DFA로 채워진 페트리 접시에 옮기다.
그런 다음 배아의 동물 측면을 방해하지 않고 식물 측에서 날카로운 집게를 사용하여 배아의 진동 막을 제거하십시오. 동물 뚜껑을 분리하려면 배아의 동물 측면을 위로 배치합니다. 동물 뚜껑의 정도를 시각적으로 추정하고 헤어 나이프로 가장자리를 따라 첫 번째 절개를하고 칼을 바깥쪽으로 당겨 잘라냅니다.
이 과정을 반복하여 작은 상처 체인을 만들어 동물 모자를 소비합니다. 메소더름 전구체가 포함되는 것을 방지하기 위해 헤어 나이프를 사용하여 동물 모자의 두꺼운 층 가장자리를 다듬습니다. 깊은 자궁 내세포세포를 동물 뚜껑에서 분리하려면 칼슘과 마그네슘이 없는 DFA로 채워진 페트리 접시에 일회용 이송 파이펫을 전달합니다.
동물 모자를 동물의 측면을 위로 향하게 배치하여 다른 각기와 는 넉넉한 거리를 유지합니다. 5~10분 정도 기다린 다음 스테레오스코프 아래에서 이절을 모니터링합니다. 느슨한 깊은 세포가 어두운 색소 피상층의 가장자리에서 방출되면 밝은 색의 깊은 자궁 세포에서 피상적 층을 들어 올리기 시작합니다.
가장자리에서 시작하여 피상적 층과 헤어 나이프를 조심스럽게 분리합니다. 그런 다음 가능한 한 적은 칼슘과 마그네슘이없는 DFA로 깊은 자궁 세포를 수집하십시오. DFA의 200 마이크로리터를 포함하는 비 접착 PCR 튜브에 깊은 ectoderm 세포를 수집하고 부드럽게 전송 된 세포를 분산하기 위해 미디어를 2 ~ 3 번 피펫.
튜브를 닫고 바닥에 자발적인 응집을 유도하기 위해 똑바로 유지하십시오. 스테레오 현미경에서 집계 프로세스를 모니터링합니다. 세포는 일반적으로 1시간 이내에 PCR 튜브의 바닥에 모여 크기에 따라 2~3시간 이내에 구형 골재로 조립합니다.
점액 상피 오르가노이드의 발달 중에 라이브 이미징 또는 약물 검사를 수행하기 위해 확대 된 팁이 장착 된 200 마이크로 리터 파이펫을 사용하여 집계 후 2 시간에서 집계를 수집합니다. 골재가 문화에서 점도 상피 오르가노이드로 발전할 수 있도록, PCR 튜브에서 5시간 후 집계하여 DFA가 채워진 페트리 요리로 옮깁니다. 응집체를 서로 멀리 떨어져 배치하여 융합을 방지합니다.
상온에서 배양후 24시간 이내에, 추가된 요인 없이, 성숙한 점액 상피 오르가노이드는 분화된 상피의 표면을 덮는 구타 섬모로 인해 회전하는 것을 관찰할 수 있다. 커버 글래스를 실리콘 그리스로 사용자 지정 밀링 아크릴 챔버에 접착하여 배양 매체의 누출을 방지하기 위해 챔버를 단단히 밀봉한 다음 이미징 챔버를 DFA로 채우는 유리 바닥 이미징 챔버를 준비합니다. 집게를 사용하여 육각형 투과 전자 현미경 또는 TEM 그리드를 선택하고 그리드의 가장자리에 소량의 그리스를 적용합니다.
가볍게 눌러 이미징 챔버의 바닥에 TEM 그리드를 고정합니다. 응집체를 이미징 챔버로 옮기고 그리드 내에 배치합니다. 챔버를 DFA로 채우고 커버 유리와 그리스로 밀봉하십시오.
점액 상피 오르가노이드 형성의 진행을 따르기 위해, 공초점 현미경을 사용하여 골재의 시간 경과 z 스택 이미지를 수집합니다. 점동 상피 오르가노이드는 초기 가스trula 단계 X.Laevis 배아의 다능한 선조에서 생성되었다. 오르가노이드는 완전히 분화 된 상피, 잔세포를 분비하는 점액, 다분면 세포 및 작은 분비 세포를 포함하여 올챙이의 표피와 구별 할 수없는 성숙한 표피를 가지고 있습니다.
오르가노이드 발달의 역학은 살아있는 화상 진찰에 선행되었습니다. 오르가노이드 형성의 초기 단계에서 나타나는 상피화를 검사하기 위해 배아는 형광표가 단단한 접합 단백질과 막을 현지화하는 단백질로 표지되었습니다. ZO-1 양성 단단한 접합 형성의 순차적 단계를 이중 라벨을 사용하면 상피화 중에 정량적으로 표시및 정량적으로 분석할 수 있다.
세포 세포 접착의 몇몇 지구는 상피화의 다른 단계에서 ZO-1의 말벌을 흩어. 반면, 다른 영역은 인접한 ZO-1 표현을 완전히 조립했습니다. 시간이 지남에 따라 말장난은 결합하고 세포 분열 중에도 자신의 형태를 유지하는 연속 꽉 접합을 형성하기 위해 연결합니다.
단단한 접합이 성숙함에 따라 세포는 오르가노이드의 정표 평면을 따라 표면안팎으로 동적으로 움직입니다. 다중 스케일 분석은 분화 유기체의 표면에 세포를 현시적으로 추적하여 가능하다. 이 프로토콜을 시도할 때, 분리된 동물 모자의 어두운 색소가 있는 면을 올려놓고 입체 범위 하에서 모니터링해야 합니다.
칼슘/마그네슘 무료 DFA 미디어에서 적절한 타이밍에 동물 모자의 피상층을 분리하는 것이 중요합니다. 이 간단한 프로토콜은 점액 상피조절분자 및 물리적 메커니즘뿐만 아니라 동적 세포 행동을 연구하는 편리한 방법을 제공합니다.
