המחבר מודה לד"ר יוג'ירו הייאשי והייאטו אישיקאווה על שסיפקו את אוסלטמיביר, וד"ר לי מקובסקי על שסיפקו את תוכניות RELIC העצמאיות. המחבר גם מכיר Tetsuya קוואגו לסיוע טכני של הניסוי QCM. עבודה זו נתמכה חלקית על ידי JSPS KAKENHI גרנט מספר 17K01363 (Y.T.).
דוח זמינות נתונים
תוכניות RELIC עצמאיות ונתוני רצף של פפטידים שנבחרו על ידי זיקה לסמים, כמו גם רצפי החלבון ממסד הנתונים פרוטאום המשמש במאמר זה זמינים ממחבר זה על פי בקשה (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).

הערה: להלן השלבים להקרנת פאג'ים T7 זיהוי סמים באמצעות biosensor QCM ושחזור פאג'ים מוקרן באמצעות E. coli (BLT5615) זיהום. הפרוטוקולים לסינתזה של נגזרת של מולקולה קטנה היוצרת מונולייר בהרכבה עצמית (SAM) ולבניית ספריית פפטיד אקראית T7 פאג 'מוצג 15-mer ניתן למצוא במקום אחר6,7.
1. הכנת שבב חיישן QCM
<ol><li>חבר שבב חיישן קרמיקה על המתנד של מנגנון QCM 27-MHz, ותקליט את התדר המהותי (Hz) בשלב האוויר לפני קיבוע מולקולה קטנה.</li>
	<li>נתק את השבב ושחרר 20 μL של פתרון (1 מ"מ ב 70% אתנול) של נגזרת מולקולה קטנה היוצרת SAM על אלקטרודה הזהב של שבב החיישן באמצעות פיפטה. התראה: גביש שבב החיישן שבו אלקטרודה זהב (Au, 0.1 מ"מ עובי, 2.5 מ"מ i.d., 4.9 מ"מ 2 )ממוקםדק מאוד ועלול להיסדק בקלות (SiO2, 0.06 מ"מ עובי, 9 מ"מ i.d.). לפיכך, פיפטה בזהירות.</li>
	<li>השאירו למשך שעה בטמפרטורת החדר (בסביבות 20 מעלות צלזיוס) בצלחת פטרי עם רקמה לחה ומוגן מפני אורות החדר.</li>
	<li>לשטוף את משטח האלקטרודה בעדינות עם מים אולטרה סגולים; לאחר מכן, להסיר את טיפות המים על ידי נושבת אוויר עם מזרק או אבק אוויר.</li>
	<li>הגדר את שבב החיישן עבור מנגנון QCM ותקליט את הירידה בתדירות בשלב האוויר כדי למדוד את כמות המולקולה הקטנה ששותקת. הערה: לפחות, 100 הרץ של תדר פנימי הכרחי עבור קיבוע מולקולה קטנה מוצלחת (1 הרץ משתקת 30 pg).</li>
</ol>2. ביופאנינג של ספריית הפאג' T7 באמצעות ביוסנסור QCM (איור 1)
<ol><li>הגדר cuvette עם stirrer מגנטי ייעודי על biosensor QCM ויוצקים 8 מ"ל של מאגר התגובה (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) לתוך cuvette.</li>
	<li>חבר את שבב חיישן QCM לתנין ומשוך את זרוע המתנד כדי לטבול את השבב לתוך החיץ מעורבב ב 1000 סל"ד.</li>
	<li>התחל לנטר את תדר QCM במחשב האישי (PC) והמתן עד שהחיישן ישווה לכ- 3 הרץ/ דקה של סחף התדרים.</li>
	<li>להזריק 8 μL של ספריית פאג T7 (1-2 × 1010 pfu / mL) לתוך cuvette (ריכוז סופי: 1-2 × 107 pfu / mL) ולסמן את נקודת ההזרקה על החיישן.</li>
	<li>לפקח על הפחתת התדר הנגרמת על ידי קשירה של פאג'ים T7 למולקולה הקטנה משותק על משטח אלקטרודה זהב במשך 10 דקות.</li>
	<li>עצרו את צג התדר QCM, הוציאו את שבב החיישן מהמתנד, והסירו את החיץ על ידי ניפוח אוויר ו/או פתיל עם מגבונים.</li>
	<li>שים את שבב החיישן לתוך צלחת פטרי לחה ושחרר את 20 μL של ההשעיה של E. coli (BLT5615) (OD600 = 0.5 -1.0 לאחר רועד ב 37 מעלות צלזיוס על ידי הוספת IPTG ל 1 mM) תאים מארחים בשלב יומן אלקטרודה זהב.</li>
	<li>סוגרים את המכסה של המנה ומכסים אותו בנייר אלומיניום כדי לחסום את האור.</li>
	<li>דגירה את המנה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות על מערבל microplate 96-היטב (1000-1500 סל"ד) לשיפור ההתאוששות של פאג'ים T7 מאוגדים.</li>
	<li>לשחזר את 20 μL של הפתרון ולהשעות אותו לתוך 200 μL של מדיום LB. הערה: הדגימות שהושגו בשלב זה ניתן לשמר ב 4 מעלות צלזיוס בשבוע אחד.</li>
	<li>הכן סדרת דילול של פתרון פאג 'לבידוד פלאק רצף DNA על פי ההליך הכללי המתואר בהוראות היצרן8,9.</li>
	<li>נגב את משטח האלקטרודה המוזהבת עם ספוגית כותנה ספוגה בתמיסת 1% נתרן דודקיל סולפט.</li>
	<li>לשטוף את משטח הזהב עם מים אולטרה מים מבקבוק הכביסה ולאחר מכן להסיר טיפות מים על ידי נושבת אוויר עם מזרק או אבק אוויר.</li>
	<li>טיפה 5 μL של פתרון פיראנה (Conc. H2SO4: 30% H2O2 = 3:1) על משטח הזהב ולהשאיר במשך 5 דקות.</li>
	<li>לשטוף את משטח הזהב שוב עם מים ולאחר מכן יבש על ידי נושבת אוויר ו / או פתיל משם עם מגבונים.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.14 ו- 2.15. התראה: הכינו את פתרון הפיראנה מיד לפני השימוש. השתמש בנוזל זה בזהירות, שכן הוא חומצה חזקה מאוד. טיפול במשך יותר מ 5 דקות שוחק את שבב החיישן.</li>
</ol>3. ניתוח ביואינפורמטיקה באמצעות קולטן ליגנד מגע (RELIC) חבילת תוכנית (איור 2)10,11
<ol><li>בטל את ההזנה של תוכנית RELIC העצמאית במחשב עם מערכת הפעלה של MS Windows.</li>
	<li>יישר את רצפי חומצות האמינו של זיקה לפפטידים של 15 מר שנבחרו באמצעות התרופה או נבחרו באופן אקראי מספריית האב הלא מסוננת בכל קובץ בתבנית טקסט (שם.txt).</li>
	<li>הקלד את רצף חומצות האמינו של חלבונים בודדים או מרובים בכל קובץ טקסט בתבנית FASTA, או הורד את קבצי הטקסט של מסד הנתונים בפורמט FASTA מכל מסד נתונים של חלבונים (למשל UniProt (http://www.uniprot.org/) או DrugBank (https://www.drugbank.ca/).</li>
	<li>מקם את קבצי הטקסט (וקבצי PDB עבור HETEROalign) בתיקיה הדרושה להפעלת כל תוכנית RELIC.</li>
	<li>לחץ על קובץ ההפעלה (תוכנית.exe) עבור AADIV, מידע, מוטיב, התאמה, HETEROalign, FASTAcon ו- FASTAskan בתיקיה העצמאית כדי לפתוח את הגירסה האישית של FTN95.</li>
	<li>הקלד את שם הקובץ המתאים, יחד עם הסיומת (שם.txt), בהודעת הפקודה כדי להפעיל כל תוכנית ולקבל את קובץ תבנית הטקסט הנדרש.</li>
	<li>יצא את קובץ הטקסט שנוצר לתוכנת גיליון אלקטרוני (למשל, Excel) כדי ליצור התוויית תוכן מידע (INFO) או ציוני דמיון מצטברים שחושבו באמצעות BLOSUM62 (MATCH, HETEROalign). הערה: שרת RELIC המקורי (http://relic.bio.anl.gov) אינו זמין עוד וכמה תוכניות RELIC עצמאיות שעובדות על מחשבים עם פלטפורמת Windows ניתן להשיג מהמחבר המתאים (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+map+of+molecular+drug+targets.">A comprehensive map of molecular drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).</li><li>Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+for+small+bioactive+molecules:+finding+the+needle+in+the+haystack.">Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack.</a> Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).</li><li>Piggott, A. M., Karuso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+cellular+targets+of+natural+products+using+T7+phage+display.">Identifying the cellular targets of natural products using T7 phage display.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 626-636 (2016).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sakaguchi, K., Sugawara, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology+for+target+determination+of+small-molecule+therapeutics:+an+update.">Phage display technology for target determination of small-molecule therapeutics: an update.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (10), 1199-1211 (2020).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+phage+display+technology+for+the+determination+of+the+targets+for+small-molecule+therapeutics.">Use of phage display technology for the determination of the targets for small-molecule therapeutics.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (4), 361-389 (2010).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+QCM+Biosensor-Based+T7+Phage+Display+Combined+with+Bioinformatics+Analysis+for+Target+Identification+of+Bioactive+Small+Molecule.">Using the QCM Biosensor-Based T7 Phage Display Combined with Bioinformatics Analysis for Target Identification of Bioactive Small Molecule.</a> Methods in Molecular Biology. 1795, 159-172 (2018).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+a+disordered+portion+of+the+Brz2001-binding+site+on+a+plant+monooxygenase,+DWARF4,+using+a+quartz-crystal+microbalance+biosensor-based+T7+phage+display.">Mapping a disordered portion of the Brz2001-binding site on a plant monooxygenase, DWARF4, using a quartz-crystal microbalance biosensor-based T7 phage display.</a> ASSAY and Drug Devevelopment Technologies. 11 (3), 206-215 (2013).</li><li>Novagen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+Select&#174;+System+Manual.">T7 Select&#174; System Manual.</a> Novagen. , (2009).</li><li>Novagen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrientExpressTM+cDNA+Manual.">OrientExpressTM cDNA Manual.</a> Novagen. , (2009).</li><li>Mandava, S., Makowski, L., Devarapalli, S., Uzubell, J., Rodi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELIC--a+bioinformatics+server+for+combinatorial+peptide+analysis+and+identification+of+protein-ligand+interaction+sites.">RELIC--a bioinformatics server for combinatorial peptide analysis and identification of protein-ligand interaction sites.</a> Proteomics. 4 (5), 1439-1460 (2004).</li><li>Makowski, L., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phage Nanobiotechnology. , 33-54 (2011).</li><li>Garcia-Carbonero, R., Supko, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+on+the+clinical+experience,+pharmacology,+and+continued+development+of+the+camptothecins.">Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 641-661 (2002).</li><li>Harel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+complex+of+the+anticancer+prodrug+7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin+(CPT-11)+with+Torpedo+californica+acetylcholinesterase+provides+a+molecular+explanation+for+its+cholinergic+action.">The crystal structure of the complex of the anticancer prodrug 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin (CPT-11) with Torpedo californica acetylcholinesterase provides a molecular explanation for its cholinergic action.</a> Molecular Pharmacology. 67 (6), 1874-1881 (2005).</li><li>Dodds, H. M., Rivory, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+for+the+inhibition+of+acetylcholinesterases+by+irinotecan+(CPT-11).">The mechanism for the inhibition of acetylcholinesterases by irinotecan (CPT-11).</a> Molecular Pharmacology. 56 (6), 1346-1353 (1999).</li><li>Bencharit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+CPT-11+activation+by+mammalian+carboxylesterases.">Structural insights into CPT-11 activation by mammalian carboxylesterases.</a> Nature Structural Biology. 9 (5), 337-342 (2002).</li><li>Kim, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+neuraminidase+inhibitors+possessing+a+novel+hydrophobic+interaction+in+the+enzyme+active+site:+design,+synthesis,+and+structural+analysis+of+carbocyclic+sialic+acid+analogues+with+potent+anti-influenza+activity.">Influenza neuraminidase inhibitors possessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site: design, synthesis, and structural analysis of carbocyclic sialic acid analogues with potent anti-influenza activity.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (4), 681-690 (1997).</li><li>Hoffmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+pharmacokinetics+of+oseltamivir+and+oseltamivir+carboxylate+in+the+central+nervous+system.">Nonclinical pharmacokinetics of oseltamivir and oseltamivir carboxylate in the central nervous system.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4753-4761 (2009).</li><li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DrugBank+5.0:+a+major+update+to+the+DrugBank+database+for+2018.">DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 1074-1082 (2018).</li><li>Takakusagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+biopanning+of+T7+phage-displayed+peptides+reveals+angiomotin+as+a+potential+receptor+of+the+anti-angiogenic+macrolide+Roxithromycin.">Multimodal biopanning of T7 phage-displayed peptides reveals angiomotin as a potential receptor of the anti-angiogenic macrolide Roxithromycin.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 809-821 (2015).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-cycle+affinity+selection+of+binding+proteins+or+peptides+specific+for+a+small-molecule+using+a+T7+phage+display+pool.">Efficient one-cycle affinity selection of binding proteins or peptides specific for a small-molecule using a T7 phage display pool.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (22), 9837-9846 (2008).</li><li>Takakusagi, Y., Suzuki, A., Sugawara, F., Kobayashi, S., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayer+(SAM)+of+small+organic+molecule+for+efficient+random-peptide+phage+display+selection+using+a+cuvette+type+quartz-crystal+micobalance+(QCM)+device.">Self-assembled monolayer (SAM) of small organic molecule for efficient random-peptide phage display selection using a cuvette type quartz-crystal micobalance (QCM) device.</a> World Journal of Engineering. 5, 1005-1006 (2009).</li><li>Kusayanagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+agent+doxorubicin+binds+to+Fanconi+anemia+group+F+protein.">The antitumor agent doxorubicin binds to Fanconi anemia group F protein.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 20 (21), 6248-6255 (2012).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+C10+biotinylated+camptothecin+(CPT-10-B)+binding+peptides+using+T7+phage+display+screen+on+a+QCM+device.">Identification of C10 biotinylated camptothecin (CPT-10-B) binding peptides using T7 phage display screen on a QCM device.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 15 (24), 7590-7598 (2007).</li><li>Rodi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+molecule+binding+sites+within+proteins+using+phage+display+technology.">Identification of small molecule binding sites within proteins using phage display technology.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 4 (7), 553-572 (2001).</li></ol>

המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

כאן, אסטרטגיה עבור biopanning מבוסס QCM biosensor של פפטידים זיהוי סמים, ואחריו ניתוח bioinformatics לאימות אינטראקציות חלבון תרופתי באמצעות פפטידים מזוהים, הוצג. תכנון נגזרות המולקולות הקטנות לשיתוק על אלקטרודת הזהב של הביוסנסור הוא צעד חשוב, שכן המקשר שהוצג עלול לעכב את הכריכה והאיסוף של הפפטיד שמכיר בתרופה. כדי למנוע זאת, נגזרים עם עמדות שונות של המקשר הציג מוכנים23. לחלופין, לשיתוק מולקולות קטנות הידרופוביות, שבב החיישן שקוע במים בתפזורת בצלחת פטרי 10 ס"מ, ותמיסת 20 μL של המולקולה הקטנה (10 מ"מ פתרון דימתיל סולפוקסיד) הוא ירד על אלקטרודה הזהב של biosensor, כדי לכסות את פני השטח שלה, דגירה במשך 5 דקות. זה מאפשר שמירה של תת מאה הרץ תדר מהותי של מולקולות קטנות, אשר מוחזק לפחות 10 דקות במהלך הביופאנינג. ואכן, באמצעות קיבוע כזה, הפפטידים שנבחרו על ידי אוסל הדגישו בבירור את האתר המחייב את אוסל ב- NA (איור 3).
פאג' T7 המשמש להכנת ספריית הפפטיד כאן מהונדס גנטית באמצעות קלטת NNK15 המקודדת 32 קודונים לכל 20 חומצות האמינו הסטנדרטיות ומדחיקה את הופעתם של 2 קודונים עוצרים (UAA, UGA) ומגיחה רק UAG (איור 1)6,7. זה חשוב להצגת פפטידים באורך מלא של 15 מר והגדלת המגוון של הספרייה. למערכת התצוגה T7 phage יש מגבלת תצוגה טכנית של 107-10 9 פאג'ים T7. עם זאת, המגוון של ספריית פפטיד 15-mer הוא תיאורטית 2015 (3.27 × 1019); לפיכך, לא ניתן להשתמש בו לבניית ספריה מלאה. עם זאת, חיפוש דמיון או כרייה של מוטיבים שמורים מאפשרים זיהוי של חומצות האמינו המרכיבות את אתרי איגוד הסמים של חלבונים אפילו עם מגוון מוגבל זה של פפטידים בספרייה. בנוסף, 3-5 חומצות אמינו נמתח בתוך פפטיד הספרייה (שיעור המראה הוא בין 1/203 ו 1/ 205, אשר ניתן לממש באמצעות מערכת התצוגה פאג T7) מעורבים בזיהוי של תרופות מולקולה קטנה; לכן, התאמה של 100% של רצפי פפטיד עם רצפי חומצות אמינו 15-mer המהווים את האתר מחייב התרופה של חלבון היעד אינו נדרש. ואכן, כ-30 פפטידים שנבחרו על ידי זיקה הדגישו בהצלחה את האתר המחייב של חלבון היעד לכל תרופה שנבדקה (איור 4). לכן, המגוון של ספריית פאג 'T7 האב בשימוש (1.7 × 107 pfu / mL) ניתן להשתמש כדי לשחזר באופן היוריסטי את האתר מחייב סמים.
בדרך כלל, 3-5 עותקים של פאג'ים T7 שהציגו רצפים זהים לאלה של רצפי חומצות אמינו 15-mer מחסה חומצות אמינו זיהוי סמים מתיחות הופיעו בתוך 16 לוחות מבודדים באופן שרירותי, המציין את ההצלחה של בחירת הזיקה תחת הפרוטוקול שלנו. הדבר מצביע על כך ש-18-30 רצפי פפטיד שונים לזיהוי סמים נאספים בתוך 96 הלוחות המבודדים (המספר משויך לפורמט המיקרופלאט), המזוהים לאחר מכן באמצעות רצף של הדנ"א והשגת רצף חומצות האמינו המתאים. באסטרטגיה הנוכחית, הזרקה של 8 μL של ספריית פאג T7 לתוך cuvette המכיל 8 מאגר מ"ל (דילול פי 1000 של הספרייה) מתאים להפחתת כריכה לא ספציפית של פאג'ים T7. כדי להגדיל את המגוון של פפטידים שנבחרו זיקה, חוזר על בחירת מחזור אחד מספר פעמים ושימוש 16 או 32 בידודים פלאק לכל הקרנה הוכיח להיות יעיל יותר מאשר בידוד מפתרון אחד בכל פעם. לדוגמה, כדי לאסוף ביעילות כ-30 פפטידים שנבחרו על-ידי זיקה ברצף שונה, נערכו 3-6 סטים של בחירת מחזור אחד, 16 או 32 לוחות בודדו בכל ניסוי. מראה של רצפים זהים בכל 16 או 32 לוחות פאג ' T7 מסומנים זיהוי מקרי של רקע או עלול זיהום כמו carryover. לעומת זאת, היעדר פאג'ים T7 עם אותו רצף או מראה של פאג'ים T7 רבים עם פפטידים קצרים יותר מאשר אורך 15-mer מציין כי פאג'ים T7 באוכלוסייה לא במיוחד הופיעו עם הסתברות גבוהה. כמו הפחתת תדר QCM מתרחשת באותה מידה גם במקרים כאלה, ההצלחה של הבחירה צריכה להיות מוערכת באופן מקיף על ידי רצף ה- DNA של פאג T7 מבודד, ואחריו ניתוח bioinformatics של רצפי חומצות אמינו של פפטידים. יתר על כן, בניגוד לפרוטוקול התצוגה הקונבנציונלי T7 פאג ', סיבובים חוזרים של בחירה הוא פחות יעיל, כמו וריאציה ומספר פאג'ים T7 הם קטנים ואינם מרוכזים גם לאחר חזרה על הגברה וקטעי בחירה23.
חשוב לציין, שיטה זו ישימה לכריית אתרים קטנים המחייבים מולקולות בפרוטומים של בני אדם, וירוסים פתוגניים ואפילו צמחים. מעניין, אורך התצוגה הקצרה אולי לא מובנה של פפטידים על קפסיד פאג T7 יכול לחקות את הדינמיקה המולקולרית של פפטידים של חלבונים במהלך עגינה עם מולקולה קטנה; פעולה זו יכולה לשקף איגוד דינאמי24. מעבר למגבלות הטכניות של שיטות קונבנציונליות, אסטרטגיה זו, החלה על פרוטוקולים זהים למולקולות קטנות, עשויה להרחיב את הפרוטום הניתן לתרופה, כמו גם לספק צפיפות רבה יותר לגבי ניתוח אינטראקציה בין חלבונים תרופתיים.
יש לשקול מגבלות טכניות מסוימות של גישה זו. סינתזה אורגנית נחוצה לשיתוק מולקולה קטנה על פני השטח של אלקטרודה זהב של שבב biosensor. עבור מי שאינם מומחים בכימיה אורגנית, ריאגנטים מסוימים של קיבוע זמינים מסחרית כדי לתקן באופן מכני את המולקולה הקטנה על ידי צימוד. יתר על כן, חלקים מסוימים שטויות של פפטידים עלול לגרום לגילוי של חלק של החלבון לא רלוונטי עבור עגינה סמים כמו חיובי כוזב. זה מתאים באופן אמפירי לתחומים עשירים בגיליון בטא או לאוצין עשירים בשאריות לאוצין או ואלין, המקודדים על ידי יותר קודונים מאשר חומצות אמינו סטנדרטיות אחרות, כאשר עותקים של פאג 'T7 מיוצרים. שליטה באורך פפטיד הספריה עשויה לשלוט במופע של תוצאות חיוביות שגויות. לעומת זאת, ייתכנו מקרים שבהם שאריות חומצות אמינו באתר מחייב הסמים המעורבים בעגינה, כפי שהוכח באמצעות קריסטלוגרפיה רנטגן או ניתוח NMR, אינם מזוהים. זה עשוי להיפתר על ידי איסוף מספר גדול יותר של פפטידים זיהוי סמים או שינוי הכיוון של תיקון של מולקולות קטנות על אלקטרודה זהב.
אינטראקציות רבות של חלבונים תרופתיים הקשורות להשפעות העיקריות והמשניות של השימוש בסמים עדיין עשויות להיות בלתי מזוהות בפרוטאום; בנוסף, אנזימים ומשגרים האחראים לספיגת תרופות, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה ורעילות, עשויים גם הם להיות עדיין בלתי מזוהים. חלבון מחייב לא תמיד אחראי על ביואקטיביות של תרופה. לכן, שילוב של מידע אחר מן מבחנים ביולוגיים ישפר את הזיהוי של מטרות סמים חיוניים האחראים על ההשפעות העיקריות והתופעות השליליות של תרופות. התאמות נוספות של טכניקה תמציתית זו יגדילו את המעשיות והתפוקה לכריית אתרי מחייבי החלבון של מגוון רחב של תרופות מולקולות קטנות. השיטה המוצגת בזאת תתרום במידה רבה לא רק לביצוע מחקרים בסיסיים בתחומים הקשורים, אלא גם להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס היעילות הטיפולית או השפעות ביולוגיות אחרות של תרופות בשימוש קליני.

זיהוי מטרות מחייבות תרופות הוא חיוני לפיתוח תרופות, כמו גם להבנת המנגנונים המולקולריים של מחלות. בפרט, קולטן וחלבוני אנזים הם המטרות המולקולריות החשובות ביותר של מולקולות קטנות ביואקטיביות 1. למרות לכידת זיקה היא טכניקה מבוססת היטב לזיהוי חלבונים מחייבי סמים2, מגבלות טכניות, כגון מסיסות נמוכה של חלבונים, לעתים קרובות לעכב את האימות של מטרות סמים2. והכי חשוב, המולקולות הקטנות משותק לאבד את מידת החופש הדרושה לעגינה ועלול להיות נגיש לאתרי קשירה הממוקמים פנימי על חלבוני יעד גדולים יותר. יתר על כן, חוסר יכולת לנתח תנאי התגבשות משותפת, ומגבלות בשל גודל מולקולרי לעתים קרובות לעכב את השימוש בקריסטלוגרפיה רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית (NMR), וניתוחים ניסיוניים אחרים כגון לחקר אינטראקציות חלבון תרופה.
השימוש ב- Biopanning של תצוגת פאג 'T7 הוא דרך יעילה לקביעת אתר האיגוד בחלבונים לפיתיונות מולקולות קטנות3. בפרט, ספריית פפטיד אקראית שהוצגה על ידי T7 phage, אשר ניתן לבנות על ידי החדרת DNA סינתטי לתוך אתר רב שיבוט, יעיל. בהשוואה לספריית הפאג'ים T7 המציגה חלבונים, ניתן לתכנן בקלות את הפפטידים הקצרים שיוצגו על קפסיד הפאג ' T7 ללא הגבלות פיזיות, אשר יכול ליצור קשר סטרטי עם כל תרופה מולקולה קטנה קבוע על תמיכה מוצקה2. יתר על כן, כניסתה של microbalance גביש קוורץ (QCM) biosensor לתוך פלטפורמת biopanning התצוגה T7 פאג מאפשר זיהוי של אינטראקציות חלשות אך ספציפיות כאלה של פפטידים קצרים עם תרופות על ידי ניטור הירידה בתדר QCM4,5. פאג' T7 מאוגד הוא התאושש ישירות על ידי הדבקת המארח Escherichia coli (BLT5615), ואת רצף ה-DNA של האזור המקודד את פפטיד שנבחרו זיקה מחסה סמים זיהוי קטעים קצרים נקבע. ניתוח עוקב של רצף חומצות האמינו של אוכלוסיית הפפטיד מספק מידע לגבי זיהוי סמים. ביישור זוגי של רצפי חומצות האמינו שניצלו ניתן להשתמש כדי לקבל מידע לגבי המטרה הביולוגית של התרופה בתוך פרוטאום נבחר. זיהוי תפוקה גבוה זה של שברי חלבון עם זיקה כלפי תרופה יכול לשמש כדי לשחזר באופן היוריסטי את האתר מחייב סמים באופן דומה לזה של שחזור חפץ עתיק מרסיסי חרס6. בפרט, גישה ייחודית זו יכולה להיות שימושית כאשר גישות פרוטאומיקה קונבנציונליות נכשלות.
כאן, אנו מציגים אסטרטגיה מבוססת biosensor עבור ביופאנינג של T7 פאג מוצג פפטידים וניתוח bioinformatics עבור אימות היעד של המולקולות הקטנות. מעבר למגבלות טכניות על שיטות קונבנציונליות, אסטרטגיה זו מאפשרת זיהוי של אתרים מחייבי תרופות בחלבוני יעד עבור כל מולקולה קטנה בעלת עניין תחת הפרוטוקול הזהה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFFINIXQN</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCM2008-STKIT</td>
			<td>Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AADIV</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>AADIV.exe</td>
			<td>Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Sensor Chip</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMST27C</td>
			<td>4 sensor chips/package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>09-0850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAcon</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAcon.exe</td>
			<td>Identifies proteins from a population with short consensus sequences.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAskan</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAskan.exe</td>
			<td>Lists proteins with high similarity to a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immiblization kit for AFFINIX</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMIMKT</td>
			<td>SAM reagent and amine coupling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFO</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>INFO.exe</td>
			<td>Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liguid LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Autoclave for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATCH</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MATCH.exe</td>
			<td>Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5&#8211;6 amino acids in length).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF1</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF1.exe</td>
			<td>Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF2</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF2.exe</td>
			<td>Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recptor ligand contacts (RELIC)</td>
			<td>Argonne National Laboratory 
			(Lemont, IL, USA)</td>
			<td>https://www.relic.anl.gov</td>
			<td>Currently unavailable 
			(Stand-alone program can be used from correspondence author upon request)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions

קולטנים וחלבוני אנזימים הם ביומולקולות חשובות הפועלים כמטרות מחייבות למולקולות קטנות ביו-אקטיביות. לכן, האימות המהיר והעולמי של אינטראקציות חלבון התרופה רצוי מאוד לא רק להבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס היעילות הטיפולית, אלא גם להערכת מאפייני סמים, כגון ספיחה, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה ורעילות (ADMET) לשימוש קליני. כאן, אנו מציגים אסטרטגיית תפוקה גבוהה מבוססת biosensor עבור ביופאנינג של פפטידים קצרים T7 פאג', כי ניתן להציג בקלות על capsid פאג'. ניתוח מאוחר יותר של רצפי חומצות האמינו של פפטידים המכילים קטעים קצרים, כמו "שרידים שבורים", של אתרי איגוד סמים באמצעות תוכניות bioinformatics בחבילת מגע ליגנד קולטן (RELIC), מוצג גם. על ידי יישום שיטה זו על שתי תרופות שאושרו קלינית, irinotecan אנטי גידול, ו oseltamivir נגד שפעת, התהליך המפורט לאיסוף רצפי פפטיד זיהוי סמים והדגשת האתרים מחייבי התרופה של חלבוני היעד מוסברים במאמר זה. האסטרטגיה המתוארת בזאת יכולה להיות מיושמת עבור כל מולקולות קטנות של עניין.

התוצאות הייצוגיות של שתי תרופות שאושרו קלינית מוצגות באיור 3. Irinotecan (איור 3A), פרודרוג מסיס במים של קמפוטותצין טבעי המשמש לטיפול בסרטן המעי הגס מתקדם וסרטן ריאות תאים שאינם קטנים, מומר SN-38 בכבד, אשר מעכב topoisomerase אני בתאי סרטן12. יתר על כן, תרכובת זו מעכבת ישירות אצטילכולין אסטראז (AChE)13,14. באמצעות האסטרטגיה, 29 פפטידים שזיהו Iri משותק כמו SAM זוהה על ידי QCM biosensor מבוססי מחזור אחד biopanning subsets. יישור זוגי עוקב של 29 פפטידים ו- AChE הניב ציונים מרביים עבור Y121, Q225, F290, E327, H440 ו- Y442 והדגיש את החלק במבנה התלת מימדי. שאריות חומצות אמינו אלה היו עולות בקנה אחד עם אלה המרכיבים את האתר מחייב Iri של AChE. אותה תת-קבוצה של פפטידים זיהתה בהצלחה את E99, L100, L252, L305, I387 ו- V474 בקרבת השלישייה הקטליטית (S221, E353 ו- H467) ב- carboxylesterase (CE), מה שמצביע על כך שחומצות אמינו אלה יוצרות פיגום לזיהוי אירי במהלך דה-אסתריזציה של Iri15. שאריות חומצות אמינו כאלה באתר הקטליטי לא ניתן לזהות ישירות באמצעות קריסטלוגרפיה רנטגן קונבנציונלי או ניתוח NMR, כמו תגובת האנזים מתקדם בצורה חלקה ואינו יוצר את קומפלקס סטטי יציב בתנאים ניסיוניים כלליים. לכן, כי זיהוי קומבינטורי של אתרי איגוד סמים של חלבונים מרובים, כולל אלה במתחמי הביניים אולי נוצר עם אנזימים במהלך תגובות מטבוליות עבור תרופה מסוימת, אפשרי באמצעות פפטידים שנבחרו זיקה שנקבעו עבור תרופה אחת.
איור 3B מראה את התוצאות האחרות שהושגו עבור oseltamivir (אוסל), תרופה נגד שפעת המופעלת oseltamivir קרבוקסילאט, אשר בתורו מעכב את neuraminidase (NA) של וירוסשפעת 16. 27 הפפטידים שזיהו את אוסל מכסה את משטח אלקטרודה זהב שבב חיישן QCM בהצלחה זיהה את האתר מחייב אוסל ב NA16. אתר כריכה זה מורכב מלולאות פפטיד לא מובנות שעלולות לעבור תנועה דינמית בעת העגינה עם אוסל. הפפטידים המזהים את אוסל על קפסיד הפאג' T7 עשויים לחקות עגינה דינמית זו בעת קשירה לאוסל הקבוע על משטח האלקטרודה המוזהבת של שבב חיישן QCM. תופעות לוואי נוירופסיכיאטריות (NPAEs) זוהו בחולים צעירים עם שפעת, אשר השפעה על חולים עשויים להיות קשורים למחלה עצמה ולא לתרופה. מחקרים הראו כי אוסל מיוצא באופן פעיל ממערכת העצבים המרכזית (CNS) של מכרסמים באמצעות חלבון התנגדות multidrug (MDR) במחסום הדם - מוח (BBB)17. ואכן, אחד החלבונים של המעמד של MDR זה הראה ציון גבוה (העליון 5% מתוך 4,396 ב DrugBank 1.0 חלבון מסד נתונים18), בנוסף טרנספורטרים אחרים, אנזימים הקשורים נוירוטרנסמיטר, קולטנים, במחקר שלנו. המשמעות הפרמקולוגית של חלבונים אלה לגבי המראה של תופעות לוואי של אוסל נחקר.
עד כה זוהו בהצלחה שישה אתרי איגוד מולקולות קטנים בודדים ומרובים בחלבוני המטרה עבור שש תרופות מולקולות קטנות שמשתמשות באסטרטגיה שלנו (איור 4). עבור Brz2001 ו roxithromycin (RXM), אתרים זהים מחייבי סמים על חלבון היעד זוהו באמצעות בריכות שונות של פפטידים, המספרים ורצפי חומצות אמינו אשר השתנו לחלוטין7,19. יתר על כן, בריכות פפטיד בודדות שהושגו עבור אירי, RXM ואוסל הובילו לזיהוי אתרי קשירה מרובים בחלבונים שונים עבור כל תרופה, כגון AChE ו- CE עבור Iri (איור 3A)20, אנגיומוטין ו CYP3A4 עבור RXM19,21, ו NA ו- MDR הקשורים חלבון עבור אוסל. מטרה מולקולרית לא ידועה זוהתה עבור תרכובת אנטי הגידול וקסורוביצ'ין (FANCF)22, ואת אנטי אנגיוגנית מקרולידים אנטי אנטיביוטי RXM (אנגיומוטין)19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig1v2.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של הביופאנינג מבוסס ה-QCM biosensor של ספריית הפפטיד המוצגת על-ידי פאג' T7. ספריית פאג' T7 המציגה פפטידים אקראיים מוזרקת לתוך ה- cuvette המכיל את החיץ (תחת ערבוב) שבו שבב ה- QCM biosensor שקוע והתדירות מיוצבת. לאחר ניטור הפחתת התדר עקב קשירה של פאג'ים T7 למולקולות קטנות משותק על פני אלקטרודה זהב של שבב החיישן, שבב החיישן מנותק מן המתנד. DNA מן פאג 'T7 מאוגד לאחר מכן התאושש ישירות לאחר המארח E. coli (BLT5615) זיהום. פאג'ים T7 וכתוצאה מכך מבודדים באמצעות היווצרות פלאק, ולבסוף, רצף חומצת האמינו של פפטיד בחר זיקה התרופה המוצג על קפסיד פאג T7 נקבע על פי שיטת התצוגה פאג 'הכללית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig2v2.jpg"> איור 2: ייצוג סכמטי של ההערכה הכמותית של השוואת הרצף בין פפטידים שנבחרו על ידי סמים לבין חלבונים בודדים או מרובים. רצפי פפטיד שנבחרו על ידי תרופות מיושרים בהתאמה עם רצפי חומצות האמינו העיקריים של חלבונים בודדים ומרובים, והדמיון בכל 3-5 ערכות חומצות אמינו הוא הבקיע במצטבר באמצעות יישור pairwise על פי מטריצת BLOSUM62 שונה. העלילה או הדיאגרמה המתקבלות מציינות את השאריות או המנות המהוות אתר פוטנציאלי למחייב סמים בחלבון. ניתוח נוסף באמצעות תוכנית RELIC מתאימה מדגיש את אתר האיגוד במבנה התלת מימדי (אם קובץ PDB זמין) או מדרג חלבונים שלמים שהם אולי יעד האיגוד (תוכנית HETEROalign אינה זמינה כעת). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig3v2.jpg"> איור 3: תוצאות מייצגות של איסוף פפטיד וניתוח ביואינפורמטיקה עוקב . (A)אירינוטקן (פרודרוג אנטי גידול, מעכב טופויסומראז I). אינטראקציית פאג' T7 הייתה במעקב במשך 10 דקות כירידה בתדירות QCM. הדנ"א של פאג' T7 המאוגד נמצא ורצף כדי לקבוע את רצף חומצות האמינו המתאים. רצפי חומצות האמינו של 29 פפטידים של 15 מר, שנאספו באמצעות תת-קבוצה של ביופאנינג במחזור אחד, הדגישו את חומצות האמינו המרכיבות את האתר המחייב Iri של AChE [PDB ID 1U65]. הערכה נוספת באמצעות אותם 29 פפטידים הדגישה את שאריות חומצות האמינו השכנות (שאריות פיגומים לביטול האסטריזציה) של השלישייה הקטליטית ב-CE, אנזים כבד הממיר את אירי ל-SN-38 (צורה פעילה) [PDB ID: 1K4Y]. ציוני הדמיון של 103 פפטידים שנבחרו באקראי מספריית האב הלא מסוננת7,19 הופחתו מציונים אלה כדי להסיר הטיית ספרייה. נתונים אלה משוחזרים משופט 20, באישורו של אלסבייר. (ב) אוזלתמיביר (תרופה נגד שפעת). 27 הפפטידים המכילים חומצות אמינו מזהה אוסל הדגישו חלקים מופרעים של האתר מחייב אוסל עבור neuraminidase (NA) (אנזים וירוס) [PDB מזהה: 2HT7]. אימות גלובלי של דמיון רצף בין 27 פפטידים ו 4,396 חלבונים ב DrugBank1.0 18 גילה NA להיות בטווח העליון 5%, בנוסף חלבונים אנושיים המארח הקשורים הפונקציות של מערכת העצבים המרכזית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig4v2.jpg"> איור 4: סיכום המולקולות הקטנות, שהיעדים המחייבים שלהן זוהו באמצעות אסטרטגיה זו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions at JoVE.com

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

מחקר זה נועד להציג אסטרטגיה לזיהוי אינטראקציות תרופתיות פפטיד. האסטרטגיה כוללת ביופאנינג של פפטידים קצרים לזיהוי תרופות המבוססים על מיקרו-איזון של גביש קוורץ (QCM), ואחריו ניתוח ביואינפורמטיקה להערכת כמותיות של המידע המתקבל להכרה בסמים וביאור של אתרי איגוד התרופות בחלבונים.

ביו-panning מבוסס Biosensor ואסטרטגיית ניתוח ביואינפורמטיקה לאימות גלובלי של אינטראקציות עם חלבונים תרופתיים

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

biosensor-based-high-throughput-biopanning-bioinformatics-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.9K Views.  National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology. מחקר זה נועד להציג אסטרטגיה לזיהוי אינטראקציות תרופתיות פפטיד. האסטרטגיה כוללת ביופאנינג של פפטידים קצרים לזיהוי תרופות המבוססים על מיקרו-איזון של גביש קוורץ (QCM), ואחריו ניתוח ביואינפורמטיקה להערכת כמותיות של המידע המתקבל להכרה בסמים וביאור של אתרי איגוד התרו...

Video: Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

קביעת תעריף הובלת xenobiotics ו ננו מעבר לשליה באמצעות<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; דגם זלוף שליה אנושי

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

שימוש בתפוקה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

ספקטרומטר תת-GHz מהירות גבוהה לניתוח פיזור רילואן

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...