O autor agradece aos Drs. Yujiro Hayashi e Hayato Ishikawa por fornecerem oseltamivir, e o Dr. Lee Makowski por fornecer os programas autônomos de RELÍQUIAS. O autor também reconhece Tetsuya Kawagoe pela assistência técnica do experimento QCM. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Número 17K01363 (Y.T.).
DECLARAÇÃO DE DISPONIBILIDADE DE DADOS
Os programas relic autônomos e os dados sequenciais de peptídeos selecionados por afinidade para medicamentos, bem como as sequências proteicas do banco de dados proteome utilizado neste artigo estão disponíveis a partir deste autor mediante solicitação (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).

NOTA: As seguintes são as etapas para a triagem de phages T7 que reconhecem medicamentos usando um biosensor QCM e recuperando as phages screened via E. coli (BLT5615) infecção. Os protocolos para a síntese de um derivado de uma pequena molécula que forma uma monocamada auto-montada (SAM) e para a construção da biblioteca de peptídeos aleatórios de 15 mer exibidas por T7 podem ser encontrados em outros lugares6,7.
1. Preparação do chip de sensor QCM
<ol><li>Conecte um chip de sensor cerâmico no oscilador de um aparelho QCM de 27 MHz e regissuça a frequência intrínseca (Hz) na fase de ar antes da imobilização de pequenas moléculas.</li>
	<li>Despeça o chip e solte 20 μL de uma solução (1 mM em 70% de etanol) de um derivado de molécula pequena que forma SAM no eletrodo de ouro do chip do sensor usando uma pipeta. ATENÇÃO: O cristal do chip de sensor onde o eletrodo de ouro (Au, 0,1 mm de espessura, 2,5 mm i.d., 4,9 mm2) está localizado é extremamente fino e pode rachar facilmente (SiO2, 0,06 mm de espessura, 9 mm i.d.). Por isso, pipeta com cuidado.</li>
	<li>Deixe por 1h em temperatura ambiente (em torno de 20 °C) em uma placa de Petri com tecido umedecido e protegido das luzes do quarto.</li>
	<li>Lave a superfície do eletrodo suavemente com água ultrapura; em seguida, remova as gotas de água soprando ar com uma seringa ou espanador de ar.</li>
	<li>Configure o chip do sensor para o aparelho QCM e registe a redução da frequência na fase de ar para medir a quantidade da pequena molécula que foi imobilizada. NOTA: Pelo menos, 100 Hz de frequência intrínseca é necessário para a imobilização de pequenas moléculas bem sucedidas (1 Hz imobiliza 30 pg).</li>
</ol>2. Biopanning da biblioteca de phage T7 usando um biosensor QCM (Figura 1)
<ol><li>Defina uma cuvette com um agitador magnético dedicado no biosensor QCM e despeje 8 mL do tampão de reação (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) no cuvette.</li>
	<li>Conecte o chip do sensor QCM ao oscilador e puxe para baixo o braço do oscilador para imergir o chip no buffer sendo agitado a 1000 rpm.</li>
	<li>Comece a monitorar a frequência QCM no computador pessoal (PC) e aguarde até que o sensorgrama se equilibre para cerca de 3 Hz/min da deriva de frequência.</li>
	<li>Injete 8 μL de uma biblioteca de phage T7 (1-2 × 1010 pfu/mL) no cuvette (concentração final: 1-2 × 107 pfu/mL) e marque o ponto de injeção no sensor.</li>
	<li>Monitore a redução de frequência causada pela ligação de phages T7 à pequena molécula imobilizada na superfície do eletrodo de ouro por 10 minutos.</li>
	<li>Pare o monitor de frequência QCM, desaloja o chip do sensor do oscilador e remova o buffer soprando ar e/ou afastando-se com lenços umedecidos.</li>
	<li>Coloque o chip de sensor em uma placa de Petri úmida e solte os 20 μL da suspensão de E. coli (BLT5615) (OD600 = 0,5 — 1,0 depois de tremer a 37 °C adicionando células hostis IPTG a 1 mM) na fase de tronco no eletrodo de ouro.</li>
	<li>Feche a tampa do prato e cubra-a com papel alumínio para bloquear a luz.</li>
	<li>Incubar o prato a 37 °C por 30 min em uma batedeira de microplacão de 96 poços (1000-1500 rpm) para melhorar a recuperação dos phages T7 ligados.</li>
	<li>Recupere os 20 μL da solução e suspenda-o em 200 μL de meio LB. NOTA: As amostras obtidas nesta etapa podem ser preservadas a 4 °C por uma semana.</li>
	<li>Prepare uma série de diluição da solução phage para isolamento da placa e sequenciamento de DNA de acordo com o procedimento geral descrito nas instruções do fabricante8,9.</li>
	<li>Limpe a superfície do eletrodo dourado com um cotonete encharcado com 1% de solução de sulfato de dodecyl de sódio.</li>
	<li>Lave a superfície dourada com água ultrauso da garrafa de lavagem e, em seguida, remova gotas de água soprando ar com uma seringa ou espanador de ar.</li>
	<li>Queda de 5 μL de solução de piranha (Conc. H2SO4: 30% H2O2 = 3:1) na superfície dourada e deixe por 5 min.</li>
	<li>Lave a superfície dourada novamente com água e depois seque soprando ar e/ou afastando-se com lenços umedecidos.</li>
	<li>Repita as etapas 2.14 e 2.15. ATENÇÃO: Prepare a solução de piranha imediatamente antes de usar. Use este líquido cuidadosamente, pois é um ácido muito forte. O tratamento por mais de 5 minutos corroe o chip do sensor.</li>
</ol>3. Análise bioinformática utilizando o conjunto do programa Receptor Ligand Contact (RELIC)(Figura 2)10,11
<ol><li>Descompacte o programa RELIC autônomo em um PC com um sistema operacional MS Windows.</li>
	<li>Alinhe as sequências de aminoácidos dos peptídeos de 15-mer selecionados usando a droga ou selecionados aleatoriamente da biblioteca pai não telada em cada arquivo de formato de texto (nome.txt).</li>
	<li>Digite a sequência de aminoácidos de proteínas únicas ou múltiplas em cada arquivo de texto com formato FASTA ou baixe os arquivos de texto do banco de dados em formato FASTA a partir de qualquer banco de dados de proteínas (por exemplo, UniProt (http://www.uniprot.org/) ou DrugBank (https://www.drugbank.ca/).</li>
	<li>Coloque os arquivos de texto (e arquivos PDB para HETEROalign) na pasta necessária para executar cada programa RELIC.</li>
	<li>Clique no arquivo executável (programa.exe) para AADIV, INFO, MOTIF, MATCH, HETEROalign, FASTAcon e FASTAskan na pasta independente para abrir a versão pessoal do FTN95.</li>
	<li>Digite o nome de arquivo apropriado, juntamente com a extensão (nome.txt), na mensagem de comando para executar cada programa e obter o arquivo de formato de texto necessário.</li>
	<li>Exporte o arquivo de texto resultante para um software de planilha (por exemplo, Excel) para gerar um plot de conteúdo de informação (INFO) ou pontuações de similaridade cumulativa calculadas usando um BLOSUM62 (MATCH, HETEROalign). NOTA: O servidor RELIC original (http://relic.bio.anl.gov) não está mais disponível e alguns programas relicários do tipo autônomo que funcionam em PCs com uma plataforma Windows podem ser obtidos do autor correspondente (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+map+of+molecular+drug+targets.">A comprehensive map of molecular drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).</li><li>Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+for+small+bioactive+molecules:+finding+the+needle+in+the+haystack.">Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack.</a> Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).</li><li>Piggott, A. 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Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Aqui, foi apresentada uma estratégia para o biopanning baseado em biosensor de peptídeos que reconhecem drogas, seguida de análise bioinformática para validação de interações medicamentosa-proteína usando os peptídeos identificados. Projetar os derivados de pequenas moléculas para imobilização no eletrodo de ouro do biosensor é um passo importante, pois o linker introduzido pode dificultar a ligação e a coleta do peptídeo que reconhece a droga. Para evitar isso, derivativos com diferentes posições do linker introduzido são preparados23. Alternativamente, para imobilizar pequenas moléculas hidrofóbicas, o chip do sensor é imerso em água a granel em uma placa de Petri de 10 cm, e uma solução de 20 μL da pequena molécula (solução de 10 mM em sulfóxido de dimetila) é lançada sobre o eletrodo de ouro do biosensor, para cobrir sua superfície, e incubada por 5 minutos. Isso permite a retenção de uma frequência intrínseca de hertz sub-cem de pequenas moléculas, que é mantida por pelo menos 10 minutos durante o biopanning. De fato, utilizando tal imobilização, os peptídeos selecionados pela afinidade osel destacaram claramente o local de vinculação de Osel em NA (Figura 3).
O phage T7 usado para preparar a biblioteca de peptídeos aqui é geneticamente modificado usando o NNK15 que codifica 32 códons para todos os 20 aminoácidos padrão e reprime o surgimento de 2 códons de parada (UAA, UGA) e emerge apenas UAG (Figura 1)6,7. Isso é importante para exibir peptídeos de 15-mer e aumentar a diversidade da biblioteca. O sistema de exibição de phage T7 tem um limite técnico de exibição de 107—109 phages T7. No entanto, a diversidade da biblioteca de peptídeos de 15-mer é teoricamente 2015 (3,27 × 1019); assim, não pode ser usado para construção completa da biblioteca. No entanto, a busca por similaridade ou mineração de motivos conservados permite a detecção dos aminoácidos que compreendem os locais de ligação de drogas de proteínas, mesmo com essa limitada diversidade de peptídeos na biblioteca. Além disso, 3-5 aminoácidos se estendem dentro do peptídeo da biblioteca (a taxa de aparência é entre 1/203 e 1/ 205, que pode ser realizado usando o sistema de exibição de phage T7) estão envolvidos no reconhecimento de pequenas moléculas drogas; portanto, não é necessário um 100% de correspondência das sequências de peptídeos com sequências de aminoácidos de 15-mer que constituem o local de ligação medicamentosa da proteína alvo. De fato, aproximadamente 30 peptídeos selecionados por afinidade destacaram com sucesso o local de ligação da proteína alvo para cada droga testada(Figura 4). Assim, a diversidade da biblioteca de phage T7 pai utilizada (1,7 × 107 pfu/mL) pode ser usada para reconstruir heuristicamente o local de ligação de drogas.
Tipicamente, 3-5 cópias de phages T7 que exibiam as mesmas sequências das sequências de aminoácidos de 15-mer que abrigam trechos de aminoácidos que reconhecem drogas surgiram dentro das 16 placas arbitrariamente isoladas, indicando o sucesso da seleção de afinidade sob nosso protocolo. Isso indica que 18-30 sequências diferentes de peptídeos que reconhecem drogas são coletadas dentro das 96 placas isoladas (o número está associado ao formato microplaca), que são identificados posteriormente usando sequenciamento do DNA e obtenção da sequência de aminoácidos correspondente. Na estratégia atual, a injeção de 8 μL da biblioteca de phage T7 no cuvette contendo tampão de 8 mL (diluição de 1000 vezes da biblioteca) é adequada para reduzir a ligação não específica de phages T7. Para aumentar a diversidade dos peptídeos selecionados por afinidade, repetir a seleção de um ciclo várias vezes e usar 16 ou 32 isolamentos de placas por triagem mostrou-se mais eficaz do que o isolamento de uma única solução de cada vez. Por exemplo, para coletar efetivamente aproximadamente 30 peptídeos selecionados por afinidade sequenciados de forma diferente, foram realizados 3-6 conjuntos de seleção de um ciclo, 16 ou 32 placas foram isoladas em cada experimento. A aparência de sequências idênticas em todas as placas de 16 ou 32 placas de phage T7 são indicadas detecção acidental de fundo ou pode contaminar como uma transferência. Em contraste, a ausência de phages T7 com a mesma sequência ou aparência de muitos phages T7 com peptídeos mais curtos do que o comprimento de 15-mer indica que os phages T7 na população não especificamente emergiram com alta probabilidade. Como a redução da frequência do QCM ocorre na mesma medida mesmo nesses casos, o sucesso da seleção deve ser amplamente avaliado sequenciando o DNA da praga isolada T7, seguida pela análise bioinformática das sequências de aminoácidos dos peptídeos. Além disso, ao contrário do protocolo convencional de exibição de phage T7, repetir rodadas de seleção é menos eficaz, pois a variação e o número dos phages T7 são pequenos e não estão concentrados mesmo após a repetição das etapas de amplificação e seleção23.
É importante ressaltar que este método é aplicável para a mineração de pequenos sítios de ligação de moléculas nos proteomes de humanos, vírus patogênicos e até plantas. Curiosamente, o comprimento de exibição curta possivelmente não estruturado de peptídeos no capsídeo de phage T7 pode imitar a dinâmica molecular dos peptídeos de proteínas durante o acoplamento com uma pequena molécula; isso pode refletir a ligação dinâmica24. Além das limitações técnicas dos métodos convencionais, essa estratégia, aplicável a protocolos idênticos para pequenas moléculas, pode expandir o proteome drogado, bem como proporcionar mais granularidade em relação à análise de interação drogada-proteína.
Algumas limitações técnicas dessa abordagem devem ser consideradas. A síntese orgânica é necessária para a imobilização de pequenas moléculas na superfície do eletrodo de ouro do chip biosensor. Para os não especialistas em química orgânica, alguns reagentes de imobilização estão disponíveis comercialmente para fixar mecanicamente a pequena molécula por acoplamento. Além disso, certas porções sem sentido dos peptídeos podem resultar na detecção de uma porção da proteína não relevante para o acoplamento de drogas como falsos positivos. Isso corresponde empiricamente a domínios ricos em folha beta ou leucinas ricos em resíduos de leucina ou valina, que são codificados por mais códons do que outros aminoácidos padrão, quando cópias do phage T7 são produzidas. Controlar o comprimento do peptídeo da biblioteca pode controlar a ocorrência de falsos positivos. Em contraste, pode haver casos em que resíduos de aminoácidos no local de ligação de drogas que estão envolvidos no acoplamento, como demonstrado usando cristalografia de raios-X ou análise de RMN, não são detectados. Isso pode ser resolvido coletando um número maior dos peptídeos que reconhecem a droga ou mudando a direção da fixação das pequenas moléculas no eletrodo de ouro.
Muitas interações medicamentosa-proteínas que estão relacionadas aos principais e secundários efeitos do uso de drogas ainda podem não ser identificadas no proteome; além disso, enzimas e transportadores responsáveis pela absorção de medicamentos, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade, também podem ainda não ser identificados. A ligação proteica nem sempre é responsável pela bioatividade de uma droga. Assim, uma combinação de outras informações de ensaios biológicos melhorará a identificação de alvos essenciais de drogas responsáveis pelos principais e adversos efeitos das drogas. Outras adaptações desta técnica concisa aumentarão a praticidade e o throughput para a mineração dos locais de ligação proteica de uma ampla gama de pequenas moléculas. O método aqui apresentado contribuirá em grande parte para não apenas realizar pesquisas básicas nos campos relacionados, mas também esclarecer os mecanismos moleculares subjacentes à eficácia terapêutica ou outros efeitos biológicos de drogas no uso clínico.

A identificação de alvos de ligação de drogas é essencial para o desenvolvimento de drogas, bem como para a compreensão dos mecanismos moleculares das doenças. Em particular, as proteínas receptoras e enzimáticas são os alvos moleculares mais importantes das pequenas moléculas bioativas1. Embora a captura de afinidade seja uma técnica bem estabelecida para identificar as proteínas de ligação medicamentosa2, limitações técnicas, como baixa solubilidade de proteínas, muitas vezes dificultam a validação de alvos medicamentosos2. Mais importante, as pequenas moléculas imobilizadas perdem o grau de liberdade necessário para o acoplamento e podem ser inacessíveis aos locais de ligação localizados internamente em proteínas alvo maiores. Além disso, a incompatibilidade de proteínas, a incapacidade de analisar as condições de co-cristalização e as limitações devido ao tamanho molecular muitas vezes dificultam o uso de cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear (RMN) e outras análises experimentais para o estudo de interações medicamentosa-proteína.
O uso do biopanning de exibição de phage T7 é uma maneira eficiente de determinar o local de ligação em proteínas para iscas de moléculas pequenas3. Em particular, uma biblioteca de peptídeos aleatórios exibida por T7, que pode ser construída inserindo DNA sintético em um local de multi-clonagem, é eficaz. Em comparação com a biblioteca de phage T7 que exibe proteínas, os peptídeos curtos podem ser facilmente projetados para serem exibidos no capsídeo de phage T7 sem restrições físicas, que podem ter contato com qualquer droga de molécula pequena fixada em um suporte sólido2. Além disso, a introdução de um biosensor de microequilísão de quartzo-cristal (QCM) na plataforma de biopanning de exibição de phage T7 permite a identificação de interações tão fracas, mas específicas, de peptídeos curtos com drogas, monitorando a redução da frequência QCM4,5. O phage T7 vinculado é então diretamente recuperado infectando o hospedeiro Escherichia coli (BLT5615), e a sequência de DNA da região que codifica o peptídeo selecionado pela afinidade que abriga segmentos curtos que reconhecem drogas é determinada. A análise subsequente da sequência de aminoácidos da população de peptídeos fornece informações sobre o reconhecimento de drogas. No alinhamento silico pairwise das sequências de aminoácidos resgatados pode ser usado para obter informações sobre o alvo biológico da droga dentro de um proteome selecionado. Esta alta identificação de fragmentos de proteína com afinidade com uma droga pode ser usada para reconstruir heusristicamente o local de ligação de drogas de forma semelhante à da reconstrução de um artefato antigo a partir de fragmentos de cerâmica6. Em particular, essa abordagem única pode ser útil quando as abordagens convencionais de proteômica falham.
Aqui, apresentamos uma estratégia baseada em biosensor para a biopanização de peptídeos e análises bioinformáticas exibidas por físeras T7 para a validação alvo das pequenas moléculas. Além das limitações técnicas sobre os métodos convencionais, essa estratégia permite a identificação de locais de ligação de drogas em proteínas-alvo para qualquer pequena molécula de interesse sob o protocolo idêntico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFFINIXQN</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCM2008-STKIT</td>
			<td>Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AADIV</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>AADIV.exe</td>
			<td>Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Sensor Chip</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMST27C</td>
			<td>4 sensor chips/package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>09-0850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAcon</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAcon.exe</td>
			<td>Identifies proteins from a population with short consensus sequences.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAskan</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAskan.exe</td>
			<td>Lists proteins with high similarity to a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immiblization kit for AFFINIX</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMIMKT</td>
			<td>SAM reagent and amine coupling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFO</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>INFO.exe</td>
			<td>Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liguid LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Autoclave for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATCH</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MATCH.exe</td>
			<td>Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5&#8211;6 amino acids in length).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF1</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF1.exe</td>
			<td>Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF2</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF2.exe</td>
			<td>Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recptor ligand contacts (RELIC)</td>
			<td>Argonne National Laboratory 
			(Lemont, IL, USA)</td>
			<td>https://www.relic.anl.gov</td>
			<td>Currently unavailable 
			(Stand-alone program can be used from correspondence author upon request)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions

Receptores e proteínas enzimáticas são biomoléculas importantes que atuam como alvos vinculantes para pequenas moléculas bioativas. Assim, a validação rápida e global das interações medicamentosa-proteína é altamente desejável não apenas para compreender os mecanismos moleculares subjacentes à eficácia terapêutica, mas também para avaliar características medicamentosas, como adsorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade (ADMET) para uso clínico. Aqui, apresentamos uma estratégia de alto rendimento baseada em biosensor para a biopanning de peptídeos curtos exibidos com phage T7 que podem ser facilmente exibidos no capsídeo phage. A análise subsequente das sequências de aminoácidos de peptídeos contendo segmentos curtos, como "relíquias quebradas", dos locais de ligação de drogas utilizando programas bioinforáticos no conjunto de ligamento receptor e contato (RELIC). Aplicando este método a dois medicamentos clinicamente aprovados, um irinotecano anti-tumor e um oseltamivir anti-flu, o processo detalhado para a coleta das sequências de peptídeos que reconhecem a droga e destacam os locais de ligação medicamentosa das proteínas-alvo são explicados neste artigo. A estratégia aqui descrita pode ser aplicada para quaisquer pequenas moléculas de interesse.

Os resultados representativos de dois medicamentos clinicamente aprovados estão na Figura 3. Irinotecan (Figura 3A), um prodrug solúvel em água de camptothecin natural usado no tratamento de câncer colorretal avançado e câncer de pulmão de células não pequenas, é convertido em SN-38 no fígado, o que inibe topoisomerase I em células cancerosas12. Além disso, este composto inibe diretamente acetilcolinesterase (AChE)13,14. Através da estratégia, 29 peptídeos que reconheceram iri imobilizado como um SAM foi identificado por subconjuntos de biopanamento de um ciclo baseados em biosensor QCM. O alinhamento emparelhado subsequente dos 29 peptídeos e AChE rendeu pontuações máximas para Y121, Q225, F290, E327, H440 e Y442 e destacou a porção na estrutura tridimensional. Estes resíduos de aminoácidos foram consistentes com aqueles que compõem o local de ligação iri de AChE. O mesmo subconjunto de peptídeos identificou com sucesso E99, L100, L252, L305, I387 e V474 nas proximidades da tríade catalítica (S221, E353 e H467) em carboxylesterase (CE), indicando que esses aminoácidos formam um andaime para reconhecimento iri durante o reconhecimento deIri. Tais resíduos de aminoácidos no local catalítico não podem ser identificados diretamente usando a cristalografia convencional de raios-X ou análise de RMN, pois a reação enzimática prossegue suavemente e não forma o complexo estático stably sob condições experimentais gerais. Assim, essa detecção combinatória de locais de ligação de drogas de múltiplas proteínas, incluindo aquelas nos complexos intermediários possivelmente formados com enzimas durante reações metabólicas para uma determinada droga, é possível usando os peptídeos selecionados por afinidade determinados para uma droga.
A Figura 3B mostra os outros resultados obtidos para oseltamivir (Osel), uma droga anti-gripe que é ativada ao carboxilato oseltamivir, que por sua vez inibe a neuraminidase (NA) do vírus da gripe16. Os 27 peptídeos que reconheceram Osel cobrindo a superfície do eletrodo de ouro do sensor QCM detectaram com sucesso o local de ligação osel na NA16. Este site de ligação consiste em loops de peptídeos não estruturados que potencialmente sofrem movimento dinâmico durante o acoplamento com Osel. Os peptídeos que reconhecem osel no capsídeo de phage T7 podem imitar esta acoplamento dinâmica ao ligar o Osel fixado na superfície do eletrodo de ouro do chip de sensor QCM. Eventos adversos neuropsiquiátricos (NPAEs) foram identificados em pacientes jovens com gripe, que efeito sobre os pacientes estão possivelmente relacionados com a doença em si e não com a droga. Estudos demonstraram que a Osel é exportada ativamente do sistema nervoso central (SNC) de roedores através da proteína de resistência multidroga (MDR) na barreira hematoencefálica (BBB)17. De fato, uma das proteínas da classe deste MDR apresentou uma pontuação alta (5% em 4.396 no banco de dados de proteínas DrugBank1.0 18), além de outros transportadores, enzimas relacionadas a neurotransmissores e receptores, em nosso estudo. A significância farmacológica dessas proteínas no que diz respeito ao aparecimento de efeitos adversos da Osel está sendo investigada.
Até agora, locais únicos e múltiplos de ligação de pequenas moléculas nas proteínas-alvo foram identificados com sucesso para seis pequenas moléculas que usam nossa estratégia(Figura 4). Para brz2001 e roxitromicina (RXM), foram identificados locais idênticos de ligação de drogas em uma proteína alvo utilizando diferentes piscinas de peptídeos, os números e sequências de aminoácidos para os quais variaram completamente7,19. Além disso, piscinas de peptídeos únicos obtidas para Iri, RXM e Osel levaram à identificação de múltiplos locais de ligação em diferentes proteínas para cada droga, como AChE e CE para Iri (Figura 3A)20,angiomotina e CYP3A4 para RXM19,21, e proteína associada a NA e MDR para Osel. Um alvo molecular desconhecido foi identificado para o composto anti-tumor doxorubicina (FANCF)22, e o antibiótico anti-angiogênico macrolide RXM (angiomotin)19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig1v2.jpg"> Figura 1: Representação esquemática do biopanning baseado em biosensor QCM da biblioteca de peptídeos exibida por phage T7. Uma biblioteca de phage T7 que exibe peptídeos aleatórios é injetada no cuvette contendo o buffer (em agitação) onde o chip biosensor QCM está imerso e a frequência é estabilizada. Depois de monitorar a redução de frequência devido à ligação de phages T7 a pequenas moléculas imobilizadas na superfície do eletrodo de ouro do chip do sensor, o chip do sensor é separado do oscilador. O DNA do phage T7 vinculado é então diretamente recuperado após a infecção pelo hospedeiro E. coli (BLT5615). Os phages T7 resultantes são isolados através da formação de placas e, finalmente, a sequência de aminoácidos do peptídeo selecionado pela afinidade da droga exibido no tcapide de phage T7 é determinada de acordo com o método geral de exibição de phage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig2v2.jpg"> Figura 2: Representação esquemática da avaliação quantitativa da comparação sequencial entre peptídeos selecionados por medicamentos e proteínas únicas ou múltiplas. As sequências de peptídeos selecionadas por drogas estão respectivamente alinhadas com as sequências primárias de aminoácidos de proteínas únicas e múltiplas, e a semelhança em cada conjunto de aminoácidos de 3-5 é cumulativamente pontuada através do alinhamento pairwise de acordo com uma matriz BLOSUM62 modificada. O enredo ou diagrama resultante indica os resíduos ou porções que constituem um local potencial de ligação de drogas na proteína. Uma análise mais aprofundada usando um programa RELIC apropriado destaca o local de vinculação na estrutura tridimensional (se o arquivo PDB estiver disponível) ou classifica proteínas inteiras que são possivelmente o alvo de ligação (o programa HETEROalign está atualmente indisponível). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig3v2.jpg"> Figura 3: Resultados representativos da coleta de peptídeos e posterior análise bioinformática. (A) Irinotecan (pró-tumor, inibidor topoisomerase I). A interação com phage T7 foi monitorada por 10 minutos como uma redução na frequência QCM. O DNA do phage T7 ligado foi recuperado e sequenciado para determinar a sequência de aminoácidos correspondente. As sequências de aminoácidos de 29 peptídeos de 15-mer, coletadas usando um subconjunto de biopanning de um ciclo, destacaram os aminoácidos que compõem o local de ligação iri de AChE [PDB ID 1U65]. Uma avaliação posterior utilizando os mesmos 29 peptídeos destacou os resíduos de aminoácidos vizinhos (resíduos de andaimes para desestrificação) da tríade catalítica em CE, enzima hepática que converte Iri em SN-38 (forma ativa) [PDB ID: 1K4Y]. Escores de similaridade de 103 peptídeos selecionados aleatoriamente da biblioteca de pais não rastreados7,19 foram subtraídos dessas pontuações para remover o viés da biblioteca. Estes números são reproduzidos a partir do Ref. 20, com permissão da Elsevier. (B) Oseltamivir (anti-gripe). Os 27 peptídeos contendo aminoácidos que reconhecem osel destacaram porções desordenadas do local de ligação osel para neuraminidase (NA) (enzima do vírus) [PDB ID: 2HT7]. A validação global da similaridade sequencial entre 27 peptídeos e 4.396 proteínas no DrugBank 1.018 revelou que a NA estava dentro da faixa de 5%, além das proteínas humanas hospedeiras associadas às funções do sistema nervoso central. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig4v2.jpg"> Figura 4:Resumo daspequenas moléculas, dos quais foram identificados os alvos de ligação utilizando essa estratégia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Este estudo teve como objetivo apresentar uma estratégia para identificar interações medicamentosa-peptídeos. A estratégia envolve o biopanning de peptídeos curtos que reconhecem drogas com base em um biosensor de microequilísã de quartzo-cristal (QCM), seguido de análise bioinformática para avaliação quantitativa das informações obtidas para o reconhecimento de medicamentos e anotação dos locais de ligação medicamentosa em proteínas.

Estratégia de análise de biopanning e bioinformática baseada em biosensor para a validação global de interações medicamentosas-proteínas

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

biosensor-based-high-throughput-biopanning-bioinformatics-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.9K visualizações.  National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology. Este estudo teve como objetivo apresentar uma estratégia para identificar interações medicamentosa-peptídeos. A estratégia envolve o biopanning de peptídeos curtos que reconhecem drogas com base em um biosensor de microequilísã de quartzo-cristal (QCM), seguido de análise bioinformática para avaliação quantitativa das informações obtidas para o reconhecimento de medicamentos e anotação dos locais de ligação medicamentosa em proteínas.

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Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

Baseados em células de Ensaio de cálcio para Médio a High Throughput Screening de Funções TRP usando FlexStation Canal 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Bioengenharia

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinação da taxa de transporte de xenobióticos e nanomateriais através da placenta usando o<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de perfusão da placenta humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

A utilização de uma alta taxa de transferência<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic Sistema de Desenvolvimento Oral Biofilms Multi-espécies

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

Alta velocidade Spectrometer Sub-GHz para Brillouin Scattering Análise

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...