L'autore ringrazia i Dottori Yujiro Hayashi e Hayato Ishikawa per aver fornito oseltamivir, e il Dr. Lee Makowski per aver fornito i programmi RELIC autonomi. L'autore riconosce anche Tetsuya Kawagoe per l'assistenza tecnica dell'esperimento QCM. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal numero di sovvenzione JSPS KAKENHI 17K01363 (Y.T.).
DICHIARAZIONE DI DISPONIBILITÀ DEI DATI
I programmi RELIC autonomi e i dati di sequenza dei peptidi selezionati per l'affinità per i farmaci, nonché le sequenze proteiche dal database del proteoma utilizzato in questo documento sono disponibili su richiesta di questo autore (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).

NOTA: I seguenti sono i passaggi per lo screening dei fagi T7 che riconoscono i farmaci utilizzando un biosensore QCM e il recupero dei fagi schermati tramite l'infezione da E. coli (BLT5615). I protocolli per la sintesi di un derivato di una piccola molecola che forma un monostrato auto-assemblato (SAM) e per la costruzione della libreria peptidica casuale da 15 anni visualizzata dal fago T7 possono essere trovati altrove6,7.
1. Preparazione del chip del sensore QCM
<ol><li>Attaccare un chip del sensore ceramico sull'oscillatore di un apparato QCM a 27 MHz e registrare la frequenza intrinseca (Hz) nella fase dell'aria prima dell'immobilizzazione di piccole molecole.</li>
	<li>Staccare il chip e far cadere 20 μL di una soluzione (1 mM in etanolo al 70%) di una piccola derivata molecolare che forma SAM sull'elettrodo doo del chip del sensore utilizzando una pipetta. ATTENZIONE: Il cristallo del chip del sensore in cui si trova l'elettrodo d'oro (Au, 0,1 mm di spessore, 2,5 mm d.d., 4,9 mm2)è estremamente sottile e può rompersi facilmente (SiO2, 0,06 mm di spessore, 9 mm i.d.). Quindi, pipetta con attenzione.</li>
	<li>Lasciare per 1 h a temperatura ambiente (circa 20 °C) in una piastra di Petri con tessuto inumidito e schermata dalle luci della stanza.</li>
	<li>Lavare delicatamente la superficie dell'elettrodo con acqua ultrapura; quindi, rimuovere le gocce d'acqua soffiando aria con una siringa o uno spolverino d'aria.</li>
	<li>Impostare il chip del sensore per l'apparato QCM e registrare la riduzione della frequenza nella fase dell'aria per misurare la quantità della piccola molecola che è stata immobilizzata. NOTA: Almeno, 100 Hz di frequenza intrinseca sono necessari per l'immobilizzazione di piccole molecole di successo (1 Hz immobilizza 30 pg).</li>
</ol>2. Biopanning della libreria di fago T7 utilizzando un biosensore QCM (Figura 1)
<ol><li>Impostare una cuvetta con un agitatore magnetico dedicato sul biosensore QCM e versare 8 mL del tampone di reazione (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) nella cuvetta.</li>
	<li>Collegare il chip del sensore QCM all'oscillatore e tirare giù il braccio dell'oscillatore per immergere il chip nel tampone che viene mescolato a 1000 giri/min.</li>
	<li>Iniziare a monitorare la frequenza QCM sul personal computer (PC) e attendere che il sensorgram equilibra a circa 3 Hz/min della deriva di frequenza.</li>
	<li>Iniettare 8 μL di una libreria di fagi T7 (1-2 ×10 10 pfu/mL) nella cuvetta (concentrazione finale: 1-2 × 107 pfu/mL) e contrassegnare il punto di iniezione sul sensore.</li>
	<li>Monitorare la riduzione di frequenza causata dal legame dei fagi T7 alla piccola molecola immobilizzata sulla superficie dell'elettrodo d'oro per 10 minuti.</li>
	<li>Arrestare il monitor di frequenza QCM, rimuovere il chip del sensore dall'oscillatore e rimuovere il buffer soffiando aria e/o assorbendo con salviette.</li>
	<li>Mettere il chip del sensore in una piastra di Petri umida e far cadere i 20 μL della sospensione di E. coli (BLT5615) (OD600 = 0,5-1,0 dopo aver tremato a 37 °C aggiungendo IPTG a 1 mM) cellule ospiti nella fase di log sull'elettrodo d'oro.</li>
	<li>Chiudere il coperchio del piatto e coprirlo con un foglio di alluminio per bloccare la luce.</li>
	<li>Incubare il piatto a 37 °C per 30 minuti su un miscelatore di micropiatte da 96 pozzetti (1000-1500 giri/min) per migliorare il recupero dei fagi T7 legati.</li>
	<li>Recuperare i 20 μL della soluzione e sospenderla in 200 μL di mezzo LB. NOTA: I campioni ottenuti in questa fase possono essere conservati a 4 °C di una settimana.</li>
	<li>Preparare una serie di diluizione della soluzione di fago per l'isolamento della placca e il sequenziamento del DNA secondo la procedura generale descritta nelleistruzioni del produttore 8,9.</li>
	<li>Pulire la superficie dell'elettrodo dorato con un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione di solfato di dodecile di sodio all'1%.</li>
	<li>Lavare la superficie urea con acqua ultrapura dalla bottiglia di lavaggio e quindi rimuovere le gocce d'acqua soffiando aria con una siringa o uno spolverino d'aria.</li>
	<li>Far cadere 5 μL di soluzione di piranha (Conc. H2SO4: 30% H2O2 = 3:1) sulla superficie urea e lasciare per 5 min.</li>
	<li>Lavare di nuovo la superficie urea con acqua e poi asciugare soffiando aria e /o assorbendo con salviette.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.14 e 2.15. ATTENZIONE: Preparare la soluzione di piranha immediatamente prima dell'uso. Utilizzare questo liquido con attenzione, in quanto è un acido molto forte. Il trattamento per più di 5 minuti erode il chip del sensore.</li>
</ol>3. Analisi bioinformatica utilizzando la suite di programmi Relic (Receptor Ligand Contact) (Figura 2)10,11
<ol><li>Decomprimere il programma RELIC autonomo su un PC con un sistema operativo MS Windows.</li>
	<li>Allineare le sequenze di amminoacidi dell'affinità dei peptidi di 15 anni selezionata utilizzando il farmaco o selezionata casualmente dalla libreria padre non schermata in ogni file di formato di testo (nome.txt).</li>
	<li>Digitare la sequenza di amminoacidi di proteine singole o multiple in ogni file di testo con formato FASTA oppure scaricare i file di testo del database in formato FASTA da qualsiasi database proteico (ad esempio UniProt (http://www.uniprot.org/) o DrugBank (https://www.drugbank.ca/).</li>
	<li>Inserire i file di testo (e i file PDB per HETEROalign) nella cartella necessaria per l'esecuzione di ogni programma RELIC.</li>
	<li>Fare clic sul file eseguibile (programma.exe) per AADIV, INFO, MOTIF, MATCH, HETEROalign, FASTAcon e FASTAskan nella cartella indipendente per aprire la versione personale di FTN95.</li>
	<li>Digitare il nome file appropriato, insieme all'estensione (nome.txt), nel messaggio di comando per eseguire ogni programma e ottenere il file di formato di testo richiesto.</li>
	<li>Esportare il file di testo risultante in un software per fogli di calcolo (ad esempio Excel) per generare un grafico del contenuto delle informazioni (INFO) o punteggi di somiglianza cumulativi calcolati utilizzando un BLOSUM62 (MATCH, HETEROalign). NOTA: il server RELIC originale (http://relic.bio.anl.gov) non è più disponibile e alcuni programmi RELIC di tipo autonomo che funzionano su PC con una piattaforma Windows possono essere ottenuti dall'autore corrispondente (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+map+of+molecular+drug+targets.">A comprehensive map of molecular drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).</li><li>Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+for+small+bioactive+molecules:+finding+the+needle+in+the+haystack.">Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack.</a> Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).</li><li>Piggott, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELIC--a+bioinformatics+server+for+combinatorial+peptide+analysis+and+identification+of+protein-ligand+interaction+sites.">RELIC--a bioinformatics server for combinatorial peptide analysis and identification of protein-ligand interaction sites.</a> Proteomics. 4 (5), 1439-1460 (2004).</li><li>Makowski, L., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phage Nanobiotechnology. , 33-54 (2011).</li><li>Garcia-Carbonero, R., Supko, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+on+the+clinical+experience,+pharmacology,+and+continued+development+of+the+camptothecins.">Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 641-661 (2002).</li><li>Harel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+complex+of+the+anticancer+prodrug+7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin+(CPT-11)+with+Torpedo+californica+acetylcholinesterase+provides+a+molecular+explanation+for+its+cholinergic+action.">The crystal structure of the complex of the anticancer prodrug 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin (CPT-11) with Torpedo californica acetylcholinesterase provides a molecular explanation for its cholinergic action.</a> Molecular Pharmacology. 67 (6), 1874-1881 (2005).</li><li>Dodds, H. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+molecule+binding+sites+within+proteins+using+phage+display+technology.">Identification of small molecule binding sites within proteins using phage display technology.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 4 (7), 553-572 (2001).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Qui è stata presentata una strategia per la biopanning a base di biosensore QCM dei peptidi che riconoscono i farmaci, seguita da un'analisi bioinformatica per la convalida delle interazioni farmaco-proteina utilizzando i peptidi identificati. Progettare i derivati delle piccole molecole per l'immobilizzazione sull'elettrodo d'oro del biosensore è un passo importante, in quanto il linker introdotto può ostacolare il legame e la raccolta del peptide che riconosce il farmaco. Per evitare questo, vengono preparate derivate con diverse posizioni del linker introdotto23. In alternativa, per immobilizzare piccole molecole idrofobiche, il chip del sensore viene immerso nell'acqua sfusa in una piastra di Petri di 10 cm e una soluzione da 20 μL della piccola molecola (soluzione da 10 mM nel solfossido di dimetile) viene lasciata cadere sull'elettrodo d'oro del biosensore, per coprirne la superficie, e incubata per 5 minuti. Ciò consente la ritenzione di una frequenza intrinseca sottocento hertz di piccole molecole, che viene trattenuta per almeno 10 minuti durante la biopanning. Infatti, utilizzando tale immobilizzazione, i peptidi selezionati per l'affinità di Osel hanno evidenziato chiaramente il sito di legame dell'Osel nella NA (Figura 3).
Il fago T7 utilizzato per preparare la libreria peptidica qui è geneticamente modificato utilizzando la cassetta NNK15 che codifica 32 codoni per tutti i 20 amminoacidi standard e reprime l'emergere di 2 codoni stop (UAA, UGA) ed emerge solo UAG(Figura 1)6,7. Questo è importante per visualizzare peptidi a figura intera di 15 anni e aumentare la diversità della libreria. Il sistema di visualizzazione del fago T7 ha un limite tecnico di visualizzazione di10 7-109 fagi T7. Tuttavia, la diversità della libreria peptidica di 15 anni è teoricamente di 2015 (3,27 × 1019); pertanto, non può essere utilizzato per la costruzione completa della biblioteca. Tuttavia, la ricerca di somiglianza o l'estrazione di motivi conservati consente di rilevare gli amminoacidi che comprendono i siti di legame farmacologico delle proteine anche con questa limitata diversità di peptidi in biblioteca. Inoltre, 3-5 amminoacidi si estendono all'interno del peptide della libreria (il tasso di aspetto è compreso tra 1/203 e 1/ 205, che può essere realizzato utilizzando il sistema di visualizzazione del fago T7) sono coinvolti nel riconoscimento di farmaci di piccole molecole; pertanto, non è necessaria una corrispondenza al 100% delle sequenze peptidiche con sequenze di amminoacidi 15-mer che costituiscono il sito di legame farmacologico della proteina bersaglio. Infatti, circa 30 peptidi selezionati per affinità hanno evidenziato con successo il sito di legame della proteina bersaglio per ciascun farmaco testato (Figura 4). Pertanto, la diversità della libreria di fagi T7 madre utilizzata (1,7 × 107 pfu/mL) può essere utilizzata per ricostruire euristicamente il sito di legame farmacologico.
Tipicamente, 3-5 copie di fagi T7 che mostravano le stesse sequenze di quelle delle sequenze di amminoacidi di 15 anni che ospitavano tratti di amminoacidi che riconoscevano farmaci emersero all'interno delle 16 placche arbitrariamente isolate, indicando il successo della selezione di affinità secondo il nostro protocollo. Ciò indica che 18-30 diverse sequenze peptidiche che riconoscono i farmaci vengono raccolte all'interno delle 96 placche isolate (il numero è associato al formato micropiatta), che vengono identificate successivamente utilizzando il sequenziamento del DNA e ottenendo la corrispondente sequenza di amminoacidi. Nella strategia attuale, l'iniezione di 8 μL della libreria di fago T7 nella cuvetta contenente tampone da 8 mL (diluizione di 1000 volte della libreria) è adatta a ridurre il legame non specifico dei fagi T7. Per aumentare la diversità dei peptidi selezionati dall'affinità, ripetere più volte la selezione a un ciclo e utilizzare 16 o 32 isolamenti della placca per screening si è rivelato più efficace dell'isolamento da una singola soluzione alla volta. Ad esempio, per raccogliere efficacemente circa 30 peptidi selezionati dall'affinità sequenziati in modo diverso, sono stati condotti 3-6 set di selezione a un ciclo, 16 o 32 placche sono state isolate in ogni esperimento. L'aspetto di sequenze identiche in tutte le placche di fago 16 o 32 T7 è indicato come rilevamento accidentale dello sfondo o potrebbe contaminazione come riporto. Al contrario, l'assenza di fagi T7 con la stessa sequenza o comparsa di molti fagi T7 con peptidi più corti rispetto alla lunghezza di 15-mer indica che i fagi T7 nella popolazione non sono emersi specificamente con alta probabilità. Poiché la riduzione della frequenza QCM avviene nella stessa misura anche in questi casi, il successo della selezione dovrebbe essere valutato in modo completo sequenziando il DNA del fago T7 isolato, seguito dall'analisi bioinformatica delle sequenze amminoacidiche dei peptidi. Inoltre, a differenza del protocollo di visualizzazione del fago T7 convenzionale, i cicli ripetuti di selezione sono meno efficaci, in quanto la variazione e il numero dei fagi T7 sono piccoli e non si concentrano anche dopo aver ripetuto le fasi di amplificazione eselezione 23.
È importante sottolineare che questo metodo è applicabile per l'estrazione di piccoli siti di legame molecolare nei proteomi dell'uomo, virus patogeni e persino piante. È interessante notare che la breve lunghezza di visualizzazione possibilmente non strutturata dei peptidi sul capsid del fago T7 può imitare la dinamica molecolare dei peptidi delle proteine durante l'aggancio con una piccola molecola; questo può riflettere l'associazionedinamica 24. Oltre ai limiti tecnici dei metodi convenzionali, questa strategia, applicabile a protocolli identici per piccole molecole, può espandere il proteoma farmaco-beneficio e fornire una maggiore granularità per quanto riguarda l'analisi dell'interazione farmaco-proteina.
Si dovrebbero prendere in considerazione alcune limitazioni tecniche di questo approccio. La sintesi organica è necessaria per l'immobilizzazione di piccole molecole sulla superficie dell'elettrodo d'oro del chip del biosensore. Per i non esperti di chimica organica, alcuni reagenti di immobilizzazione sono commercialmente disponibili per fissare meccanicamente la piccola molecola accoppiando. Inoltre, alcune porzioni senza senso dei peptidi potrebbero comportare il rilevamento di una porzione della proteina non rilevante per l'attracco dei farmaci come falsi positivi. Ciò corrisponde empiricamente a domini ricchi di beta-fogli o leucine ricchi di leucina o residui di valine, che sono codificati da più codoni rispetto ad altri amminoacidi standard, quando vengono prodotte copie del fago T7. Il controllo della lunghezza peptidica della libreria potrebbe controllare il verificarsi di falsi positivi. Al contrario, ci possono essere casi in cui non vengono rilevati residui di amminoacidi nel sito di legame farmacologico coinvolti nell'attracco, come dimostrato utilizzando la cristallografia a raggi X o l'analisi NMR. Questo può essere risolto raccogliendo un maggior numero di peptidi che riconoscono il farmaco o cambiando la direzione di fissaggio delle piccole molecole sull'elettrodo d'oro.
Molte interazioni farmaco-proteina correlate ai principali e secondari effetti del consumo di stupefacenti possono ancora non essere identificate nel proteoma; inoltre, anche gli enzimi e i trasportatori responsabili dell'assorbimento, della distribuzione, del metabolismo, dell'escrezione e della tossicità dei farmaci potrebbero non essere ancora identificati. Il legame proteico non è sempre responsabile della bioattività di un farmaco. Pertanto, una combinazione di altre informazioni provenienti da saggi biologici migliorerà l'identificazione degli obiettivi essenziali in materia di farmaci responsabili degli effetti principali e negativi dei farmaci. Ulteriori adattamenti di questa tecnica concisa aumenteranno la praticità e la produttività per l'estrazione dei siti di legame proteico di una vasta gamma di farmaci a piccole molecole. Il metodo qui presentato contribuirà in gran parte non solo a condurre ricerche di base nei campi correlati, ma chiarirà anche i meccanismi molecolari alla base dell'efficacia terapeutica o di altri effetti biologici dei farmaci nell'uso clinico.

L'identificazione di obiettivi vincolanti per i farmaci è essenziale per lo sviluppo di farmaci e per la comprensione dei meccanismi molecolari delle malattie. In particolare, i recettori e le proteine enzimatiche sono i più importanti bersagli molecolari delle piccole molecolebioattive 1. Sebbene la cattura dell'affinità sia una tecnica ben consolidata per identificare le proteine legantifarmaci 2, i limiti tecnici, come la bassa solubilità delle proteine, spesso ostacolano la convalida degli obiettivi del farmaco2. Ancora più importante, le piccole molecole immobilizzate perdono il grado di libertà necessario per l'attracco e possono essere inaccessibili ai siti di legame situati internamente su proteine bersaglio più grandi. Inoltre, il misfolding proteico, l'incapacità di analizzare le condizioni di co-cristallizzazione e le limitazioni dovute alle dimensioni molecolari spesso ostacolano l'uso della cristallografia a raggi X, della risonanza magnetica nucleare (NMR) e di altre analisi sperimentali per lo studio delle interazioni farmaco-proteina.
L'uso della biopanning del display del fago T7 è un modo efficiente per determinare il sito di legame sulle proteine per le esche di piccole molecole3. In particolare, una libreria peptidica casuale visualizzata dal fago T7, che può essere costruita inserendo DNA sintetico in un sito multi-clonazione, è efficace. Rispetto alla libreria di fago T7 che mostra proteine, i peptidi corti possono essere facilmente progettati per essere visualizzati sul capsid del fago T7 senza restrizioni fisiche, che può stericamente contatto con qualsiasi farmaco di piccola molecola fissato su un supporto solido2. Inoltre, l'introduzione di un biosensore qcm (quartz-crystal microbalance) nella piattaforma di biopanning del display del fago T7 consente l'identificazione di interazioni così deboli ma specifiche di peptidi corti con farmaci monitorando la riduzione della frequenza QCM4,5. Il fago T7 legato viene quindi recuperato direttamente infettando l'ospite Escherichia coli (BLT5615), e viene determinata la sequenza di DNA della regione che codifica il peptide selezionato dall'affinità che ospita brevi segmenti che riconoscono i farmaci. L'analisi successiva della sequenza amminoacidica della popolazione peptidica fornisce informazioni sul riconoscimento dei farmaci. Nel silico l'allineamento a coppie delle sequenze di amminoacidi salvati può essere utilizzato per ottenere informazioni sul bersaglio biologico del farmaco all'interno di un proteoma selezionato. Questa identificazione ad alta produttività di frammenti proteici con affinità verso un farmaco può essere utilizzata per ricostruire euristicamente il sito di legame farmacologico in modo simile a quello della ricostruzione di un antico manufatto da frammenti di ceramica6. In particolare, questo approccio unico può essere utile quando gli approcci proteomici convenzionali falliscono.
Qui presentiamo una strategia basata sul biosensore per la biopanning dei peptidi visualizzati dal fago T7 e l'analisi bioinformatica per la convalida target delle piccole molecole. Al di là delle limitazioni tecniche sui metodi convenzionali, questa strategia consente l'identificazione di siti di legame farmacologico sulle proteine bersaglio per qualsiasi piccola molecola di interesse secondo lo stesso protocollo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFFINIXQN</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCM2008-STKIT</td>
			<td>Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AADIV</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>AADIV.exe</td>
			<td>Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Sensor Chip</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMST27C</td>
			<td>4 sensor chips/package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>09-0850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAcon</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAcon.exe</td>
			<td>Identifies proteins from a population with short consensus sequences.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAskan</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAskan.exe</td>
			<td>Lists proteins with high similarity to a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immiblization kit for AFFINIX</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMIMKT</td>
			<td>SAM reagent and amine coupling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFO</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>INFO.exe</td>
			<td>Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liguid LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Autoclave for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATCH</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MATCH.exe</td>
			<td>Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5&#8211;6 amino acids in length).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF1</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF1.exe</td>
			<td>Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF2</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF2.exe</td>
			<td>Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recptor ligand contacts (RELIC)</td>
			<td>Argonne National Laboratory 
			(Lemont, IL, USA)</td>
			<td>https://www.relic.anl.gov</td>
			<td>Currently unavailable 
			(Stand-alone program can be used from correspondence author upon request)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions

I recettori e le proteine enzimatiche sono importanti biomolecole che fungono da bersagli vincolanti per piccole molecole bioattive. Pertanto, la convalida rapida e globale delle interazioni farmaco-proteina è altamente auspicabile non solo per comprendere i meccanismi molecolari alla base dell'efficacia terapeutica, ma anche per valutare le caratteristiche del farmaco, come adsorbimento, distribuzione, metabolismo, escrezione e tossicità (ADMET) per uso clinico. Qui, presentiamo una strategia ad alta produttività basata su biosensore per la biopanning di peptidi corti visualizzati dal fago T7 che possono essere facilmente visualizzati sul capsid del fago. Viene anche mostrata la successiva analisi delle sequenze di amminoacidi dei peptidi contenenti brevi segmenti, come "reliquie rotte", dei siti di legame farmacologico che utilizzano programmi di bioinformatica nella suite di contatto con ligando recettore (RELIC). Applicando questo metodo a due farmaci clinicamente approvati, un irinotecan antitumoro e un oseltamivir anti-influenzale, il processo dettagliato per la raccolta delle sequenze peptidiche che riconoscono i farmaci e l'evidenziazione dei siti di legame farmacologico delle proteine bersaglio sono spiegati in questo documento. La strategia descritta nel presente documento può essere applicata per qualsiasi piccola molecola di interesse.

I risultati rappresentativi di due farmaci clinicamente approvati sono riportati nella figura 3. L'irinotecan (Figura 3A), un profarmaco solubile in acqua di camptotecina naturale utilizzato per il trattamento del cancro del colon-retto avanzato e del cancro polmonare non a piccole cellule, viene convertito in SN-38 nel fegato, che inibisce la topoisomerasi I nelle cellule tumorali12. Inoltre, questo composto inibisce direttamente l'acetilcolinesterasi (AChE)13,14. Attraverso la strategia, 29 peptidi che riconoscevano Iri immobilizzato come SAM sono stati identificati da sottoinsiemi di biopanning a ciclo unico basati su biosensore QCM. Il successivo allineamento a coppie dei 29 peptidi e dell'AChE ha prodotto punteggi massimi per Y121, Q225, F290, E327, H440 e Y442 e ha evidenziato la porzione nella struttura tridimensionale. Questi residui di amminoacidi erano coerenti con quelli che covano il sito iri-legante di AChE. Lo stesso sottoinsieme di peptidi identificò con successo E99, L100, L252, L305, I387 e V474 nelle vicinanze della triade catalitica (S221, E353 e H467) in carbossilesterasi (CE), indicando che questi amminoacidi formano un'impalcatura per il riconoscimento Iri durante la de-esterificazione di Iri15. Tali residui di amminoacidi nel sito catalitico non possono essere identificati direttamente utilizzando la cristallografia a raggi X convenzionale o l'analisi NMR, poiché la reazione enzimatica procede senza intoppi e non forma il complesso statico stabilmente in condizioni sperimentali generali. Pertanto, il rilevamento combinatorio di siti di legame farmacologico di più proteine, comprese quelle nei complessi intermedi eventualmente formati con enzimi durante le reazioni metaboliche per un particolare farmaco, è possibile utilizzando i peptidi selezionati dall'affinità determinati per un farmaco.
La figura 3B mostra gli altri risultati ottenuti per l'oseltamivir (Osel), un farmaco antinfluenzale che viene attivato sull'oseltamivir carbossilato, che a sua volta inibisce la neuraminidasi (NA) del virus influenzale16. I 27 peptidi che hanno riconosciuto Osel che copre la superficie dell'elettrodo d'oro del chip del sensore QCM hanno rilevato con successo il sito di legame Osel in NA16. Questo sito di legame è costituito da anelli peptidici non strutturati che potenzialmente subiscono un movimento dinamico durante l'attracco con Osel. I peptidi che riconoscono l'Osel sul capsid del fago T7 potrebbero imitare questo docking dinamico quando si legano all'Osel fissato sulla superficie dell'elettrodo dorato del chip del sensore QCM. Eventi avversi neuropsichiatrici (NPAE) sono stati identificati in giovani pazienti con influenza, che effetto sui pazienti sono probabilmente correlati alla malattia stessa piuttosto che al farmaco. Gli studi hanno dimostrato che Osel viene attivamente esportato dal sistema nervoso centrale (SNC) dei roditori attraverso proteine multifarmaco-resistenza (MDR) nella barriera emato-encefalica (BBB)17. Infatti, una delle proteine della classe di questo MDR ha mostrato un punteggio elevato (top 5% su 4.396 nel database delle proteine DrugBank 1.018), oltre ad altri trasportatori, enzimi correlati al neurotrasmettitore e recettori, nel nostro studio. Si sta indagando sul significato farmacologico di queste proteine per quanto riguarda la comparsa di effetti avversi dell'Osel.
Finora, siti di legame di piccole molecole singole e multiple sulle proteine bersaglio sono stati identificati con successo per sei piccoli farmaci molecolari che utilizzano la nostra strategia (Figura 4). Per Brz2001 e roxitromicina (RXM), sono stati identificati siti identici di legame farmacologico su una proteina bersaglio utilizzando diverse pozze di peptidi, i cui numeri e sequenze di amminoacidi variavanocompletamente 7,19. Inoltre, le singole piscine peptidiche ottenute per Iri, RXM e Osel hanno portato all'identificazione di più siti di legame su proteine diverse per ogni farmaco, come AChE e CE per Iri(Figura 3A)20,angiomotina e CYP3A4 per RXM19,21e proteina associata a NA e MDR per Osel. È stato identificato un bersaglio molecolare sconosciuto per il composto antitumomico doxorubicina (FANCF)22e l'antibiotico macrolide anti-angiogenico RXM (angiomotina)19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig1v2.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica della biopanning basata su biosensore QCM della libreria peptidica visualizzata dal fago T7. Una libreria di fago T7 che visualizza peptidi casuali viene iniettata nella cuvetta contenente il buffer (sotto agitazione) dove il chip biosensore QCM è immerso e la frequenza è stabilizzata. Dopo aver monitorato la riduzione della frequenza dovuta al legame dei fagi T7 a piccole molecole immobilizzate sulla superficie dell'elettrodo d'oro del chip del sensore, il chip del sensore viene staccato dall'oscillatore. Il DNA del fago T7 legato viene quindi recuperato direttamente dopo l'infezione dell'ospite E. coli (BLT5615). I fagi T7 risultanti sono isolati attraverso la formazione di placche e, infine, la sequenza di amminoacidi del peptide selezionato dall'affinità del farmaco visualizzato sul capsid del fago T7 è determinata in base al metodo generale di visualizzazione del fago. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig2v2.jpg"> Figura 2: Rappresentazione schematica della valutazione quantitativa del confronto di sequenza tra peptidi selezionati dal farmaco e proteine singole o multiple. Le sequenze peptidiche selezionate dal farmaco sono rispettivamente allineate con le sequenze primarie di amminoacidi di proteine singole e multiple, e la somiglianza in ogni set di amminoacidi 3-5 viene segnata cumulativamente tramite allineamento a coppie secondo una matrice BLOSUM62 modificata. Il grafico o il diagramma risultante indica i residui o le porzioni che costituiscono un potenziale sito di legame farmacologico sulla proteina. Ulteriori analisi utilizzando un programma RELIC appropriato evidenziano il sito di associazione sulla struttura tridimensionale (se è disponibile un file PDB) o classificano intere proteine che sono probabilmente la destinazione di associazione (il programma HETEROalign non è attualmente disponibile). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig3v2.jpg"> Figura 3: Risultati rappresentativi della raccolta dei peptidi e successiva analisi bioinformatica. (A) Irinotecan (profarmaco antitumoro, topoisomerasi I inibitore). L'interazione del fago T7 è stata monitorata per 10 minuti come riduzione della frequenza QCM. Il DNA del fago T7 legato è stato recuperato e sequenziato per determinare la corrispondente sequenza di amminoacidi. Le sequenze di amminoacidi di 29 peptidi da 15 mer, raccolte utilizzando un sottoinsieme di biopanning a ciclo unico, hanno evidenziato gli amminoacidi che coendono il sito iri-legante di AChE [PDB ID 1U65]. Ulteriori valutazione utilizzando gli stessi 29 peptidi hanno evidenziato i residui di amminoacidi vicini (residui di impalcatura per la deesterificazione) della triade catalitica in CE, un enzima epatico che converte Iri in SN-38 (forma attiva) [PDB ID: 1K4Y]. Punteggi di somiglianza di 103 peptidi selezionati casualmente dalla libreria principale non schermata7,19 sono stati sottratti da questi punteggi per rimuovere i pregiudizi della libreria. Queste cifre sono riprodotte dal ref. (B) Oseltamivir (farmaco antinfluenzale). I 27 peptidi contenenti amminoacidi che riconoscono osel hanno evidenziato porzioni disordinate del sito legante osel per la neuraminidasi (NA) (enzima virus) [PDB ID: 2HT7]. La convalida globale della somiglianza della sequenza tra 27 peptidi e 4.396 proteine in DrugBank 1.018 ha rivelato che NA rientra nella gamma superiore del 5%, oltre alle proteine umane ospiti associate alle funzioni del sistema nervoso centrale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig4v2.jpg"> Figura 4: Sintesi delle piccole molecole, i cui obiettivi di legame sono stati identificati utilizzando questa strategia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Questo studio mirava a presentare una strategia per identificare le interazioni farmaco-peptidico. La strategia prevede la biopanning di peptidi corti che riconoscono farmaci basati su un biosensore QCM (Quartz-Crystal Microbalance), seguito da un'analisi bioinformatica per valutare quantitativamente le informazioni ottenute per il riconoscimento del farmaco e l'annotazione dei siti di legame farmacologico sulle proteine.

Strategia di biopanning e analisi bioinformatica ad alta produttività basata su biosensore per la convalida globale delle interazioni farmaco-proteina

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

biosensor-based-high-throughput-biopanning-bioinformatics-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.9K Views.  National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology. Questo studio mirava a presentare una strategia per identificare le interazioni farmaco-peptidico. La strategia prevede la biopanning di peptidi corti che riconoscono farmaci basati su un biosensore QCM (Quartz-Crystal Microbalance), seguito da un'analisi bioinformatica per valutare quantitativamente le informazioni ottenute per il riconoscimento del farmaco e l'annotazione dei siti di legame farmacologico sulle proteine.

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Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

Saggio basato su cellule di calcio per le medie e High Throughput Screening del PRT Funzioni canale utilizzando FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Ricerca

Bioingegneria

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polimerici per Discovery High Throughput di Biomateriali

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

High-throughput generatore di espressione delle proteine ​​Utilizzando una piattaforma microfluidica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Microscopia correlativa per l&#39;analisi strutturale 3D di Interazioni Dinamiche

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinazione del tasso di trasporto di xenobiotici e nanomateriali attraverso la placenta con il<em&gt; Ex vivo</em&gt; Umano Modello perfusione placentare

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

L&#39;uso di un high-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic sistema per sviluppare orale biofilm Multi-specie

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

Alta velocità sub-GHz spettrometro per l&#39;analisi di Brillouin Scattering

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...