저자는 하야시 유지로 박사와 이시카와 하야토 박사에게 오셀타미비르를 제공한 것에 대해 감사하고, 이마코프스키 박사는 독립형 유물 프로그램을 제공해 주셔서 감사합니다. 저자는 또한 QCM 실험의 기술 적 지원에 대한 테츠야 카와고에 인정. 이 작품은 JSPS KAKENHI 그랜트 번호 17K01363 (Y.T.)에 의해 부분적으로 지원되었다.
데이터 가용성 문
독립형 유물 프로그램 및 약물에 대한 친화성 선택 펩티드의 서열 데이터뿐만 아니라 이 논문에 사용된 프로테오메 데이터베이스의 단백질 서열은 요청 시 이 저자로부터 구할 수 있다(tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).

참고: 다음은 QCM 바이오 센서를 사용하여 약물 인식 T7 파지를 선별하고 대장균(BLT5615) 감염을 통해 선별된 파지를 회수하는 단계입니다. 자가 조립단층(SAM)을 형성하는 소분자의 유도체의 합성을 위한 프로토콜과 T7 파지 표시 15-메르 무작위 펩티드 라이브러리의 시공을 위해6,7.
1. QCM 센서 칩 의 준비
<ol><li>27-MHz QCM 장치의 발진기에 세라믹 센서 칩을 부착하고 소분자 고정 전에 공기 단계에서 본질적인 주파수(Hz)를 기록합니다.</li>
	<li>칩을 분리하고 피펫을 사용하여 센서 칩의 금 전극에 SAM을 형성하는 작은 분자 유도체의 용액(70% 에탄올에서 1mM)의 20 μL을 떨어뜨립니다. 주의: 금 전극(Au, 0.1mm 두께, 2.5mm i.d., 4.9 mm2)이위치한 센서 칩 크리스탈은 매우 얇고 쉽게 균열될 수 있습니다(SiO2,0.06mm 두께, 9mm i.d.). 따라서 파이펫을 조심스럽게 피펫하십시오.</li>
	<li>모이스텐 티슈가 있는 페트리 접시에 실온(약 20°C)에서 1시간 동안 방치하고 실내 조명으로부터 보호합니다.</li>
	<li>초순수로 전극 표면을 부드럽게 씻으십시오. 그런 다음 주사기 나 공기 먼지로 공기를 불어 물 방울을 제거합니다.</li>
	<li>QCM 장치에 대한 센서 칩을 설정하고 고정화된 소분자의 양을 측정하기 위해 공기 상에서 주파수의 감소를 기록한다. 참고: 성공적인 소분자 고정(1Hz 고정 30pg)에 대해 적어도 100Hz의 내재 주파수가 필요합니다.</li>
</ol>2. QCM 바이오 센서를 이용한 T7 파지 라이브러리의 바이오패닝(도 1)
<ol><li>QCM 바이오센서에 전용 자기 교반기로 큐벳을 설정하고 반응 버퍼(10m Tris-HCl, 200mM NaCl, pH 7-8)를 커벳에 부어 넣습니다.</li>
	<li>QCM 센서 칩을 발진기에 부착하고 발진기 의 팔을 아래로 당겨 칩을 1000 rpm에 교반되는 버퍼에 담급십시오.</li>
	<li>개인용 컴퓨터(PC)에서 QCM 주파수를 모니터링하고 센서그램이 주파수 드리프트의 약 3Hz/분으로 평형화될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>T7 파지 라이브러리(1-2 ×10 pfu/mL)의 8μL을 큐벳에 주입하고(최종 농도: 1-2 × 107 pfu/mL)를 센서의 주입 지점을 표시합니다.</li>
	<li>10분 동안 금 전극 표면에 고정된 작은 분자에 T7 파지의 결합으로 인한 주파수 감소를 모니터링한다.</li>
	<li>QCM 주파수 모니터를 중지하고, 발진기에서 센서 칩을 빼내고, 공기를 불어 넣거나 물티슈로 굴절하여 버퍼를 제거합니다.</li>
	<li>센서 칩을 습한 페트리 접시에 넣고 대장균(BLT5615)의 서스펜션의 20 μL(OD600 = 0.5-1.0에서 37°C에서 흔들어진 후 1mMM)의 호스트 셀을 금 전극에 로그 단계에서 놓는다. </li>
	<li>접시 뚜껑을 닫고 알루미늄 호일로 덮어 빛을 차단합니다.</li>
	<li>결합된 T7 파지의 회수를 향상시키기 위해 96웰 마이크로플레이트 믹서(1000-1500 rpm)에서 37°C에서 30분 동안 접시를 배양한다.</li>
	<li>용액의 20 μL을 복구하고 LB 매체의 200 μL로 일시 중단합니다. 참고: 이 단계에서 얻은 샘플은 1주일 까지 4°C로 보존될 수 있다.</li>
	<li>제조업체의 지침8,9에기술된 일반적인 절차에 따라 플라크 격리 및 DNA 염기서열에 대한 파지 용액의 희석 시리즈를 준비한다.</li>
	<li>1% 나트륨 도데킬 황산염 용액에 담근 면봉으로 금 전극 표면을 닦아냅니다.</li>
	<li>금표면을 세척병의 초순수물로 씻은 다음 주사기 나 공기 먼지로 공기를 불어 물 방울을 제거합니다.</li>
	<li>피라냐 용액 5 μL을 떨어뜨리고(Conc. H2SO4: 30% H2O2 = 3:1) 금 표면에 5분 간 둡니다.</li>
	<li>금 표면을 물로 다시 씻은 다음 공기를 불어 넣거나 물티슈로 굴려 말리십시오.</li>
	<li>2.14 및 2.15 단계를 반복합니다. 주의: 사용 직전에 피라냐 솔루션을 준비하십시오. 매우 강한 산이기 때문에 이 액체를 신중하게 사용하십시오. 5분 이상 트리트먼트를 통해 센서 칩이 침식됩니다.</li>
</ol>3. 수용체 리간드 접촉 (RELIC) 프로그램 제품군을 이용한 생물 정보학 분석(그림 2)10,11
<ol><li>MS Windows 운영 체제가 있는 PC에서 독립 실행형 RELIC 프로그램의 압축을 해제합니다.</li>
	<li>약물을 사용하여 선택된 15-메르 펩티드친의 아미노산 서열을 정렬하거나 각 텍스트 형식 파일(name.txt)에서 비스크린 부모 라이브러리에서 무작위로 선택된다.</li>
	<li>FASTA 형식으로 각 텍스트 파일에 단일 또는 다중 단백질의 아미노산 서열을 입력하거나 모든 단백질 데이터베이스(예: UniProt(http://www.uniprot.org/) 또는 DrugBank(https://www.drugbank.ca/)에서 FASTA 형식으로 데이터베이스 텍스트 파일을 다운로드합니다.</li>
	<li>각 RELIC 프로그램을 실행하는 데 필요한 폴더에 텍스트 파일(및 HETEROalign용 PDB 파일)을 배치합니다.</li>
	<li>독립 폴더에서 AADIV, 정보, MOTIF, MATCH, HETEROalign, FASTAcon 및 FASTAskan에 대한 실행 파일(프로그램.exe)을 클릭하여 FTN95의 개인 버전을 엽니다.</li>
	<li>각 프로그램을 실행하고 필요한 텍스트 형식 파일을 얻기 위해 명령 메시지에 확장(이름.txt)과 함께 적절한 파일 이름을 입력합니다.</li>
	<li>결과 텍스트 파일을 스프레드시트 소프트웨어(예: Excel)로 내보내 BLOSUM62(MATCH, HETEROalign)를 사용하여 계산된 정보 콘텐츠(INFO) 또는 누적 유사성 점수의 플롯을 생성합니다. 참고: 원래 RELIC 서버(http://relic.bio.anl.gov)는 더 이상 사용할 수 없으며 Windows 플랫폼이 있는 PC에서 작동하는 일부 독립 실행형 RELIC 프로그램은 해당 작성자(tkksg@rs.noda.tus.ac.jp)로부터 얻을 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+map+of+molecular+drug+targets.">A comprehensive map of molecular drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).</li><li>Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+for+small+bioactive+molecules:+finding+the+needle+in+the+haystack.">Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack.</a> Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).</li><li>Piggott, A. M., Karuso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+cellular+targets+of+natural+products+using+T7+phage+display.">Identifying the cellular targets of natural products using T7 phage display.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 626-636 (2016).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sakaguchi, K., Sugawara, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology+for+target+determination+of+small-molecule+therapeutics:+an+update.">Phage display technology for target determination of small-molecule therapeutics: an update.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (10), 1199-1211 (2020).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+phage+display+technology+for+the+determination+of+the+targets+for+small-molecule+therapeutics.">Use of phage display technology for the determination of the targets for small-molecule therapeutics.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (4), 361-389 (2010).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+QCM+Biosensor-Based+T7+Phage+Display+Combined+with+Bioinformatics+Analysis+for+Target+Identification+of+Bioactive+Small+Molecule.">Using the QCM Biosensor-Based T7 Phage Display Combined with Bioinformatics Analysis for Target Identification of Bioactive Small Molecule.</a> Methods in Molecular Biology. 1795, 159-172 (2018).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+a+disordered+portion+of+the+Brz2001-binding+site+on+a+plant+monooxygenase,+DWARF4,+using+a+quartz-crystal+microbalance+biosensor-based+T7+phage+display.">Mapping a disordered portion of the Brz2001-binding site on a plant monooxygenase, DWARF4, using a quartz-crystal microbalance biosensor-based T7 phage display.</a> ASSAY and Drug Devevelopment Technologies. 11 (3), 206-215 (2013).</li><li>Novagen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+Select&#174;+System+Manual.">T7 Select&#174; System Manual.</a> Novagen. , (2009).</li><li>Novagen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrientExpressTM+cDNA+Manual.">OrientExpressTM cDNA Manual.</a> Novagen. , (2009).</li><li>Mandava, S., Makowski, L., Devarapalli, S., Uzubell, J., Rodi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELIC--a+bioinformatics+server+for+combinatorial+peptide+analysis+and+identification+of+protein-ligand+interaction+sites.">RELIC--a bioinformatics server for combinatorial peptide analysis and identification of protein-ligand interaction sites.</a> Proteomics. 4 (5), 1439-1460 (2004).</li><li>Makowski, L., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phage Nanobiotechnology. , 33-54 (2011).</li><li>Garcia-Carbonero, R., Supko, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+on+the+clinical+experience,+pharmacology,+and+continued+development+of+the+camptothecins.">Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 641-661 (2002).</li><li>Harel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+complex+of+the+anticancer+prodrug+7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin+(CPT-11)+with+Torpedo+californica+acetylcholinesterase+provides+a+molecular+explanation+for+its+cholinergic+action.">The crystal structure of the complex of the anticancer prodrug 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin (CPT-11) with Torpedo californica acetylcholinesterase provides a molecular explanation for its cholinergic action.</a> Molecular Pharmacology. 67 (6), 1874-1881 (2005).</li><li>Dodds, H. M., Rivory, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+for+the+inhibition+of+acetylcholinesterases+by+irinotecan+(CPT-11).">The mechanism for the inhibition of acetylcholinesterases by irinotecan (CPT-11).</a> Molecular Pharmacology. 56 (6), 1346-1353 (1999).</li><li>Bencharit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+CPT-11+activation+by+mammalian+carboxylesterases.">Structural insights into CPT-11 activation by mammalian carboxylesterases.</a> Nature Structural Biology. 9 (5), 337-342 (2002).</li><li>Kim, C. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DrugBank+5.0:+a+major+update+to+the+DrugBank+database+for+2018.">DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 1074-1082 (2018).</li><li>Takakusagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+biopanning+of+T7+phage-displayed+peptides+reveals+angiomotin+as+a+potential+receptor+of+the+anti-angiogenic+macrolide+Roxithromycin.">Multimodal biopanning of T7 phage-displayed peptides reveals angiomotin as a potential receptor of the anti-angiogenic macrolide Roxithromycin.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 809-821 (2015).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-cycle+affinity+selection+of+binding+proteins+or+peptides+specific+for+a+small-molecule+using+a+T7+phage+display+pool.">Efficient one-cycle affinity selection of binding proteins or peptides specific for a small-molecule using a T7 phage display pool.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (22), 9837-9846 (2008).</li><li>Takakusagi, Y., Suzuki, A., Sugawara, F., Kobayashi, S., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayer+(SAM)+of+small+organic+molecule+for+efficient+random-peptide+phage+display+selection+using+a+cuvette+type+quartz-crystal+micobalance+(QCM)+device.">Self-assembled monolayer (SAM) of small organic molecule for efficient random-peptide phage display selection using a cuvette type quartz-crystal micobalance (QCM) device.</a> World Journal of Engineering. 5, 1005-1006 (2009).</li><li>Kusayanagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+agent+doxorubicin+binds+to+Fanconi+anemia+group+F+protein.">The antitumor agent doxorubicin binds to Fanconi anemia group F protein.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 20 (21), 6248-6255 (2012).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+C10+biotinylated+camptothecin+(CPT-10-B)+binding+peptides+using+T7+phage+display+screen+on+a+QCM+device.">Identification of C10 biotinylated camptothecin (CPT-10-B) binding peptides using T7 phage display screen on a QCM device.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 15 (24), 7590-7598 (2007).</li><li>Rodi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+molecule+binding+sites+within+proteins+using+phage+display+technology.">Identification of small molecule binding sites within proteins using phage display technology.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 4 (7), 553-572 (2001).</li></ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

여기서, DNA 인식 펩티드의 QCM 바이오센서 계 바이오패닝에 대한 전략이 제시되었으며, 이어서 확인된 펩티드를 이용한 약물 단백질 상호 작용을 검증하기 위한 생물정보학 분석이 제시되었다. 바이오센서의 금 전극에 고정을 위한 소분자 유도체의 설계는 중요한 단계이며, 도입된 링커는 약물을 인식하는 펩티드의 결합 및 수집을 방해할 수 있기 때문에. 이를 방지하기 위해 도입된 링커의 상이한 위치를 가진 파생상품은23을준비한다. 대안적으로, 소수성 소분자를 고정하기 위해 센서 칩은 10cm 페트리 접시에 벌크 워터에 침지되고, 소분자(디메틸 설프리산화물의 10mM MM 용액)의 20 μL 용액을 바이오 센서의 금 전극에 떨어뜨리고, 표면을 덮고, 5분 동안 인큐베이팅된다. 이것은 biopanning 도중 적어도 10 분 동안 개최되는 작은 분자의 하위 백 헤르츠 본질적인 주파수의 보존을 허용합니다. 실제로, 이러한 고정화를 이용하여, Osel 친화성 선택 펩타이드는NA(그림 3)에서Osel 결합 부위를 명확하게 강조했다.
여기에 펩티드 라이브러리를 준비하는 데 사용되는 T7 파지는 표준 아미노산 20개 모두에 대해 32코동을 인코딩하고 2스톱 코돈(UAA, UGA)의 출현을 억압하는 NNK15 카세트를 사용하여 유전자 조작되어 UAG(그림1)6,7개만나타난다. 이것은 15-mer 전체 길이 펩티드를 표시하고 라이브러리의 다양성을 증가시키는 데 중요합니다. T7 파지 디스플레이 시스템에는 기술 디스플레이제한이 10 7~109 T7 파지입니다. 그러나, 15-메르 펩티드 라이브러리의 다양성은 이론적으로 2015 (3.27 × 1019);; 따라서 완전한 라이브러리 구성에는 사용할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, 보존모티프의 유사성 검색 또는 채굴은 라이브러리에서 펩타이드의 제한된 다양성에도 불구하고 단백질의 약물 결합 부위를 포함하는 아미노산의 검출을 가능하게 한다. 또한, 3-5 아미노산은 라이브러리 펩티드 내에서 뻗어 있다(외관 속도는 1/203 과 1/205사이이며, 이는 T7 파지 디스플레이 시스템을 사용하여 실현될 수 있음) 소분자 약물의 인식에 관여한다; 따라서, 표적 단백질의 약물 결합 부위를 구성하는 15-메르 아미노산 서열과 펩티드 서열의 100% 일치가 필요하지 않다. 실제로, 약 30개의 친화성 선택 펩타이드는 시험된 각 약물에 대한 표적 단백질의 결합 부위를 성공적으로강조했다(도 4). 따라서, 사용되는 부모 T7 파지 라이브러리의 다양성(1.7 × 107 pfu/mL)은 약물 결합 부위를 추론적으로 재구성하는 데 사용될 수 있다.
전형적으로, 3-5 T7 파지의 사본은 약물 인식 아미노산을 품고 있는 15-mer 아미노산 서열의 것과 동일한 서열을 표시하여 임의로 격리된 16개의 플라크 내에서 나타났으며, 이는 우리의 프로토콜에 따른 친화성 선택의 성공을 나타냅니다. 이는 DNA의 시퀀싱을 이용하여 이후에 확인된 96개의 플라크(마이크로플레이트 포맷과 연관된 수)에서 18-30개의 상이한 약물 인식 펩티드 서열이 수집되고 해당 아미노산 서열을 획득한다는 것을 나타낸다. 본 전략에서, T7 파지 라이브러리의 8μL을 8mL 버퍼(라이브러리의 1000배 희석)를 포함하는 큐벳에 주입하는 것은 T7 파지의 비특이적 결합을 감소시키는 데 적합하다. 선호도 선택 펩티드의 다양성을 높이기 위해, 1주기 선택을 여러 번 반복하고 스크리닝당 16 또는 32개의 플라크 절연을 사용하여 한 번에 단일 솔루션으로부터 격리보다 더 효과적인 것으로 판명되었다. 예를 들어, 약 30개의 상시 시퀀싱 친화성 선택 펩티드를 효과적으로 수집하기 위해, 3-6세트의 1주기 선택이 수행되었고, 각각의 실험에서 16 또는 32개의 플라크가 격리되었다. 모든 16 또는 32 T7 파지 플라크에서 동일한 서열의 모양은 배경의 우발적 인 검출을 표시하거나 이월로 오염 될 수 있습니다. 대조적으로, 15-mer 길이보다 더 짧은 펩타이드를 가진 많은 T7 파지의 동일한 서열 또는 외관을 가진 T7 파지의 부재는 인구에서 T7 파지가 특별히 높은 확률로 나타났다는 것을 나타낸다. 이러한 경우에도 QCM 주파수 감소가 동일한 정도로 발생함에 따라, 펩티드의 아미노산 서열의 생물정보학 분석이 선행된 격리된 T7 파지의 DNA를 시퀀싱하여 선택의 성공을 종합적으로 평가해야 한다. 더욱이, 종래의 T7 파지 디스플레이 프로토콜과 달리, T7 파지의 변형과 수가 작고 증폭 및 선택단계(23)를반복한 후에도 집중되지 않기 때문에 반복라운드선택이 덜 효과적이다.
중요한 것은, 이 방법은 인간, 병원성 바이러스 및 식물의 프로테옴에 있는 작은 분자 결합 사이트의 마이닝에 적용됩니다. 흥미롭게도, T7 파지 캡시드에 펩티드의 아마도 구조화되지 않은 짧은 디스플레이 길이는 작은 분자로 도킹하는 동안 단백질의 펩티드의 분자 역학을 모방 할 수 있습니다; 이는 동적바인딩(24)을반영할 수 있습니다. 종래의 방법의 기술적 한계를 넘어, 소분자를 위한 동일한 프로토콜에 적용되는 이 전략은 약물 성 프로테오메를 확장할 뿐만 아니라 약물 단백질 상호 작용 분석에 관하여 더 세분성을 제공할 수 있다.
이 방법의 특정 기술적 한계를 고려해야 합니다. 유기 합성은 바이오 센서 칩의 금 전극 표면에 작은 분자 고정에 필요합니다. 유기 화학의 비 전문가의 경우 일부 고정 시약은 결합을 통해 소분자를 기계적으로 수정할 수 있습니다. 더욱이, 펩티드의 특정 넌센스 부분은 거짓 긍정으로 약물 도킹에 관련되지 않은 단백질의 일부를 검출하는 결과를 초래할 수 있다. 이는 T7 파지의 복사본이 생성될 때 다른 표준 아미노산보다 더 많은 코돈에 의해 인코딩되는 류신 또는 발린 잔류물이 풍부한 베타 시트 또는 류신이 풍부한 도메인에 경험적으로 대응한다. 라이브러리 펩티드 길이를 제어하면 거짓 긍정의 발생을 제어할 수 있습니다. 대조적으로, X선 결정학 또는 NMR 분석을 사용하여 입증된 바와 같이 도킹에 관여하는 약물 결합 부위의 아미노산 잔류물이 검출되지 않는 경우가 있을 수 있다. 이는 더 많은 수의 약물 인식 펩티드를 수집하거나 금 전극상에 작은 분자의 고정 방향을 변경함으로써 해결될 수 있다.
약물 사용의 주요 및 이차 효과와 관련된 많은 약물 단백질 상호 작용은 아직 프로테오메에서 확인되지 않을 수 있습니다. 또한 약물 흡수, 분포, 신진 대사, 배설 및 독성을 담당하는 효소 및 수송기도 여전히 확인되지 않을 수 있습니다. 단백질 결합은 약물의 생체 활성에 항상 책임이 있는 것은 아닙니다. 따라서, 생물학적 애사에서 다른 정보의 조합은 약물의 주요 및 부작용에 대한 책임 필수 약물 표적의 식별을 향상시킬 것이다. 이 간결한 기술의 추가 적응은 작은 분자 약의 넓은 범위의 단백질 결합 사이트의 채굴을 위한 실용성과 처리량을 증가시킬 것입니다. 본 원에 제시된 방법은 관련 분야에서 기초 연구를 수행할 뿐만 아니라 임상 사용시 약물의 치료 효능 또는 기타 생물학적 효과에 기초한 분자 메커니즘을 명확히 하는 데 크게 기여할 것이다.

약물 결합 표적의 식별은 질병의 분자 메커니즘을 이해하는 것 뿐만 아니라 약물 개발에 필수적입니다. 특히, 수용체 및 효소 단백질은 생리활성 소분자1의가장 중요한 분자 표적이다. 친화성 포획은 약물 결합 단백질2,단백질의 낮은 용해도 와 같은 기술적 한계를 식별하기 위한 잘 확립된 기술이지만, 종종 약물 표적2의유효성검사를 방해한다. 가장 중요한 것은, 고정된 작은 분자는 도킹에 필요한 자유의 정도를 잃고 더 큰 표적 단백질에 내부적으로 위치한 결합 부위에 접근할 수 없을 지도 모릅니다. 더욱이, 단백질 오접기, 공동 결정화 조건을 분석할 수 없음, 분자 크기로 인한 제한은 종종 X 선 결정학, 핵 자기 공명(NMR) 및 약물 단백질 상호 작용을 연구하기 위한 기타 실험 분석의 사용을 방해합니다.
T7 파지 디스플레이 바이오패닝의 사용은 소분자 미끼3에대한 단백질에 대한 결합 부위를 결정하는 효율적인 방법입니다. 특히, 합성 DNA를 다중 복제 부위에 삽입하여 생성할 수 있는 T7 파지 표시 랜덤 펩티드 라이브러리가 효과적이다. 단백질을 표시하는 T7 파지 라이브러리에 비해, 짧은 펩타이드는 물리적 제한 없이 T7 파지 캡시드에 쉽게 표시되도록 설계될 수 있으며, 이는 고체지지체 2에고정된 소분자 약물과 sterically 접촉할 수 있다. 더욱이, T7 파지 디스플레이 바이오패닝 플랫폼에 석영 결정 마이크로밸런스(QCM) 바이오센서를 도입하여 QCM 주파수4,5의감소를 모니터링함으로써 약물과의 짧은 펩타이드의 약하지만 구체적인 상호작용을 식별할 수 있다. 상기 바운드 T7 파지는 숙주 대장균(BLT5615)을 감염시킴으로써 직접 회수되고, 친화성 선택펩타이드 항만을 인코딩하는 영역의 DNA 서열이 약물 인식 짧은 세그먼트를 결정한다. 펩티드 집단의 아미노산 서열의 후속 분석은 약물 인식에 관한 정보를 제공한다. 실리코쌍으로 구조된 아미노산 서열의 정렬은 선택된 프로테오메 내에서 약물의 생물학적 표적에 관한 정보를 얻기 위해 사용될 수 있다. 약물에 대한 친화력을 가진 단백질 단편의 이러한 높은 처리량 식별은 도자기 파편으로부터 고대 유물을 재구성하는 것과 유사한 방식으로 약물 결합 부위를 추론적으로 재구성하는 데 사용될 수 있다6. 특히, 이러한 독특한 접근법은 기존의 프로테오믹스 접근법이 실패할 때 유용할 수 있다.
여기서, 우리는 소분자의 표적 검증을 위한 T7 파지 표시 펩타이드 및 생물정보학 분석의 바이오패닝을 위한 바이오센서 기반 전략을 제시한다. 기존의 방법에 대한 기술적 한계를 넘어, 이 전략은 동일한 프로토콜에 따라 관심의 작은 분자에 대한 대상 단백질에 약물 결합 부위의 식별을 가능하게한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFFINIXQN</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCM2008-STKIT</td>
			<td>Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AADIV</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>AADIV.exe</td>
			<td>Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Sensor Chip</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMST27C</td>
			<td>4 sensor chips/package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>09-0850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAcon</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAcon.exe</td>
			<td>Identifies proteins from a population with short consensus sequences.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAskan</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAskan.exe</td>
			<td>Lists proteins with high similarity to a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immiblization kit for AFFINIX</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMIMKT</td>
			<td>SAM reagent and amine coupling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFO</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>INFO.exe</td>
			<td>Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liguid LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Autoclave for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATCH</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MATCH.exe</td>
			<td>Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5&#8211;6 amino acids in length).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF1</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF1.exe</td>
			<td>Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF2</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF2.exe</td>
			<td>Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recptor ligand contacts (RELIC)</td>
			<td>Argonne National Laboratory 
			(Lemont, IL, USA)</td>
			<td>https://www.relic.anl.gov</td>
			<td>Currently unavailable 
			(Stand-alone program can be used from correspondence author upon request)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions

수용체와 효소 단백질은 생리 활성 소분자의 결합 표적역할을 하는 중요한 생체 분자입니다. 따라서 약물 단백질 상호 작용의 신속하고 글로벌한 검증은 치료 효능의 근본적인 분자 메커니즘을 이해하는 것뿐만 아니라 임상 사용을 위한 흡착, 분포, 대사, 배설 및 독성(ADMET)과 같은 약물 특성을 평가하기도 매우 바람직하다. 여기서, 우리는 쉽게 파지 캡시드에 표시 할 수있는 T7 파지 표시 짧은 펩타이드의 바이오 패닝에 대한 바이오 센서 기반의 높은 처리량 전략을 제시한다. 짧은 세그먼트를 포함하는 펩티드의 아미노산 서열의 후속 분석은 수용체 리간드 접촉(RELIC) 제품군에서 생물정보학 프로그램을 이용한 약물 결합 부위의 "깨진 유물"로, 또한 도시된다. 이 방법을 임상적으로 승인된 약물, 항종양 irinotecan 및 항독감 oseltamivir에 적용함으로써, 약물 인식 펩티드 서열을 수집하고 표적 단백질의 약물 결합 부위를 강조하기 위한 상세한 과정이 본 논문에서 설명된다. 본명에 기재된 전략은 관심있는 임의의 작은 분자에 적용될 수 있다.

임상적으로 승인된 2개의 약에 대한 대표적인 결과는 도 3에도시된다. 이리노테칸(도3A)은첨단 대장암 및 비소세포 폐암 치료에 사용되는 천연 캄토테신의 수용성 프로약으로, 간에서 SN-38로 전환되어암세포에서 12개의토포아솜라제를 억제한다. 더욱이, 이 화합물은 직접 아세틸콜린테라아제 (AChE)13,14를억제한다. 이 전략을 통해 Iri를 SAM으로 인식한 29개의 펩타이드는 QCM 바이오센서 기반 1주기 바이오패닝 서브셋에 의해 확인되었다. 후속 29 펩티드와 AChE의 쌍방향 정렬은 Y121, Q225, F290, E327, H440 및 Y442에 대한 최대 점수를 산출하고 3차원 구조의 부분을 강조했다. 이러한 아미노산 잔류물은 AChE의 Iri 결합 부위를 구성하는 것과 일치했습니다. 펩타이드의 동일한 하위 집합은 성공적으로 E99, L100, L252, L305, I387 및 V474를 카복틸레스트라이스트(CE)의 촉매 트라이어드(S221, E353 및 H467) 부근에서 확인하여, 이러한 아미노산이15년동안 에스테르리 인식에 대한 에스테르리(ester)를 형성한다는 것을 나타낸다. 촉매 부위의 이러한 아미노산 잔기는 효소 반응이 원활하게 진행되고 일반적인 실험 조건 하에서 정전기 복합체를 안정적으로 형성하지 않기 때문에 기존의 X선 결정학 또는 NMR 분석을 사용하여 직접 식별할 수 없다. 따라서, 특정 약물에 대한 대사 반응 중에 효소로 형성될 가능성이 있는 중간 복합체를 포함하여 다중 단백질의 약물 결합 부위의 결합적 검출은, 1개의 약물에 대해 결정된 친화성 선택 펩티드를 이용하여 가능하다.
도 3B는 오셀타미비르(Oseltamivir)에 대해 수득된 다른 결과를 나타내며, 이는 인플루엔자바이러스(16)의뉴라미니다아제(NA)를 억제하는 오셀타미비르 카박스틸레이트로 활성화된다. QCM 센서 칩 금 전극 표면을 덮는 Osel을 인식한 펩타이드 27개에서는 NA16에서Osel 결합 부위를 성공적으로 검출했다. 이 결합 부위는 Osel과 도킹하는 동안 동적 움직임을 겪을 수 있는 비정형 펩타이드 루프로 구성됩니다. T7 파지 캡시드의 Osel 인식 펩타이드는 QCM 센서 칩의 금 전극 표면에 고정된 오셀에 결합할 때 이 동적 도킹을 모방할 수 있습니다. 신경 정신과 부작용 (NPOEs) 인플루엔자를 가진 젊은 환자에서 확인 되었습니다., 환자에 미치는 영향은 아마도 약물 보다는 질병 자체와 관련 된. 연구 결과에 따르면 Osel은 혈액-뇌 장벽(BBB) 17에서 다약물 내성(MDR) 단백질을 통해 설치류의 중추 신경계(CNS)에서 활발히 수출되고 있음을입증하였다. 실제로, 이 MDR의 클래스의 단백질 중 하나는 높은 점수를 보였다 (5% 밖으로 4,396 DrugBank에서 1.0 단백질 데이터베이스18),다른 수송기 이외에, 신경 전달 물질 관련 효소, 그리고 수용 체, 우리의 연구에서. Osel의 부작용의 출현과 관련하여 이러한 단백질의 약리학적 중요성이 조사되고 있습니다.
지금까지 표적 단백질에 대한 단일 및 다중 작은 분자 결합 부위는 6개의 소분자 약물에 대해 성공적으로 확인되었으며 우리의전략(그림 4)을사용하고 있다. Brz2001 및 roxithromycin (RXM)의 경우, 표적 단백질에 대한 동일한 약물 결합 부위는 펩티드의 상이한 풀을 사용하여 확인되었으며, 숫자와 아미노산 서열은 완전히7,19로변화했다. 더욱이, Iri, RXM 및 Osel을 위해 얻은 단일 펩타이드 풀은 Iri를 위한 AChE 및CE(도 3A)20,혈관모틴 및 CYP3A4와 같은 각 약물에 대한 다양한 단백질에 대한 다중 결합 부위의 식별을 주도했으며, RXM19,21,NA 및 MDR 관련 단백질을 위한 것이다. 항종양 화합물 독소루비신(FANCF) (FANCF)(22)및 항 혈관유발 거형 대식RXM(angiomotin)19에대해 알려지지 않은 분자 표적을 확인하였다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig1v2.jpg"> 도 1: T7 파지 표시 펩티드 라이브러리의 QCM 바이오 센서 기반 바이오패닝의 회로도 표현. 임의의 펩티드를 표시하는 T7 파지 라이브러리는 QCM 바이오센서 칩이 침지되고 주파수가 안정화되는 버퍼(아래 교반)를 포함하는 큐벳에 주입된다. 센서 칩의 금 전극 표면에 고정된 작은 분자에 T7 파지의 결합으로 인한 주파수 감소를 모니터링한 후, 센서 칩은 발진기에서 분리된다. 결합된 T7 파지에서 DNA는 호스트 대장균 (BLT5615) 감염 후에 직접 복구됩니다. 결과 T7 파지는 플라크 형성을 통해 격리되고, 마지막으로, T7 파지 캡시드상에 표시되는 약물 친화성 선택 펩티드의 아미노산 서열은 일반적인 파지 표시 방법에 따라 결정된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig2v2.jpg"> 도 2:약물선택 펩티드와 단일 또는 다중 단백질 간의 서열 비교의 정량적 평가의 회로도 표현. 약물 선택 펩티드 서열은 각각 단일 및 다중 단백질의 1차 아미노산 서열과 정렬되며, 각 3-5 아미노산 세트에서의 유사성은 수정된 BLOSUM62 매트릭스에 따라 쌍방향으로 정렬을 통해 누적적으로 득점된다. 결과 플롯 또는 다이어그램은 단백질에 대한 잠재적약물 결합 부위를 구성하는 잔류물 또는 부분을 나타낸다. 적절한 RELIC 프로그램을 사용하는 추가 분석은 3차원 구조(PDB 파일을 사용할 수 있는 경우)에 대한 결합 부위를 강조하거나 결합 대상인 전체 단백질의 순위를 매입니다(HETEROalign 프로그램은 현재 사용할 수 없음). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig3v2.jpg"> 그림 3:펩티드 수집 및 후속 생물 정보학 분석의 대표적인 결과. (A)이리노테칸(항종양 프로약물, 토포이소라제 I 억제제). T7 파지 상호 작용은 QCM 주파수의 감소로 10 분 동안 모니터링되었다. 바운드 된 T7 파지의 DNA는 회수 및 대응 아미노산 서열을 결정하기 위해 시퀀스되었다. 1주기 바이오파닝의 하위 집합을 사용하여 수집된 29개의 15-메르 펩타이드의 아미노산 서열은 AChE의 Iri 결합 부위를 구성하는 아미노산을 강조했다[PDB ID 1U65]. 동일한 29펩타이드를 이용한 추가 평가는 이리를 SN-38(활성 형태)으로 변환하는 간 효소인 CE의 촉매 트리아드의 인접한 아미노산 잔류물(탈 에스테르화를 위한 스캐폴드 잔류물)을 강조했다[PDB ID: 1K4Y]. 비스크린 부모 라이브러리7,19로부터 무작위로 선택된 펩티드 103의 유사성 점수는 라이브러리 바이어스를 제거하기 위해 이들 점수에서 빼고 있다. 이 수치는 엘스비어의 허락을 받아 참조 20에서 재현됩니다. (B) 오셀타미비르 (항독감 약물). 상기 27개의 펩티드는 오셀 인식 아미노산을 함유한 뉴라미니다아제(NA)(바이러스 효소)를 위한 오셀 결합 부위의 무질서한 부분을 강조했다[PDB ID: 2HT7]. 약물뱅크 1.018에서 27개의 펩타이드와 4,396개의 단백질 사이의 서열 유사성에 대한 글로벌 검증결과 NA는 중추신경계의 기능과 관련된 숙주 인간 단백질 외에도 상위 5% 범위 내에 있는 것으로 나타났다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig4v2.jpg"> 그림 4: 작은 분자의 요약, 이 전략을 사용하여 확인된 결합 표적. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

이 연구는 약물 펩티드 상호 작용을 식별하기위한 전략을 제시하는 것을 목표로했다. 이 전략은 석영 결정 마이크로 밸런스 (QCM) 바이오 센서에 기초한 약물 인식 짧은 펩타이드의 바이오 패닝을 포함하고, 단백질에 대한 약물 인식 및 약물 결합 부위의 음장 에 대해 얻은 정보를 정량적으로 평가하기위한 생물 정보학 분석이 뒤따릅니다.

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

FlexStation 3을 사용 TRP 채널 기능의 높은 처리량 검사하는 매체를위한 셀 기반의 칼슘 분석

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

연구

생체공학

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

태반의 맞은 편에 생체이 물과 나노 물질의 전송 속도의 결정을 사용하여<em&gt; 생체</em&gt; 인간 태반 관류 모델

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

브릴 루앙 산란 분석을위한 고속 서브 GHz의 분광계

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...