Der Autor dankt Drs. Yujiro Hayashi und Hayato Ishikawa für die Bereitstellung von Oseltamivir und Dr. Lee Makowski für die Bereitstellung der eigenständigen RELIC-Programme. Der Autor würdigt auch Tetsuya Kawagoe für die technische Unterstützung des QCM-Experiments. Diese Arbeit wurde teilweise von JSPS KAKENHI Grant Number 17K01363 (Y.T.) unterstützt.
DATENVERFÜGBARKEITS-ANWEISUNG
Die eigenständigen RELIC-Programme und die Sequenzdaten von affinitätsausgewählten Peptiden für Medikamente sowie die in dieser Arbeit verwendeten Proteinsequenzen aus der Proteom-Datenbank sind bei diesem Autor auf Anfrage erhältlich (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).

HINWEIS: Im Folgenden sind die Schritte zum Screening von T7-Phagen mit Hilfe eines QCM-Biosensors und zur Wiederherstellung der gescreenten Phagen mittels E. coli -Infektion (BLT5615). Die Protokolle für die Synthese eines Derivats eines kleinen Moleküls, das eine selbst zusammengesetzte Monoschicht (SAM) bildet, und für den Aufbau der T7-Phagen-angezeigten 15-mer-Zufallspeptidbibliothek finden Sie an anderer Stelle6,7.
1. Vorbereitung des QCM-Sensorchips
<ol><li>Befestigen Sie einen Keramik-Sensorchip am Oszillator eines 27-MHz-QCM-Geräts und zeichnen Sie die Eigenfrequenz (Hz) in der Luftphase vor der kleinen Molekülimmobilisierung auf.</li>
	<li>Lösen Sie den Chip und lassen Sie 20 l einer Lösung (1 mM in 70% Ethanol) eines kleinen Molekülderivats, das SAM bildet, mit einer Pipette auf die Goldelektrode des Sensorchips fallen. VORSICHT: Der Sensorchip-Kristall, in dem sich die Goldelektrode (Au, 0,1 mm dick, 2,5 mm i.d., 4,9 mm2) befindet, ist extrem dünn und kann leicht reißen (SiO2, 0,06 mm dick, 9 mm i.d.). Daher Pipette sorgfältig.</li>
	<li>1 h bei Raumtemperatur (ca. 20 °C) in einer Petrischale mit befeuchteten Gewebe und vor Raumbeleuchtung abgeschirmt lassen.</li>
	<li>Waschen Sie die Elektrodenoberfläche sanft mit reinem Wasser; entfernen Sie dann die Wassertropfen, indem Sie Luft mit einer Spritze oder einem Luftstaubsauger blasen.</li>
	<li>Richten Sie den Sensorchip für das QCM-Gerät ein und zeichnen Sie die Frequenzreduzierung in der Luftphase auf, um die Menge des kleinen Moleküls zu messen, das immobilisiert wurde. HINWEIS: Mindestens 100 Hz Eigenfrequenz ist für eine erfolgreiche kleine Molekülimmobilisierung notwendig (1 Hz immobilisiert 30 pg).</li>
</ol>2. Biopanning der T7-Phagenbibliothek mit einem QCM-Biosensor (Abbildung 1)
<ol><li>Setzen Sie eine Küvette mit einem speziellen Magnetrührer auf den QCM-Biosensor und gießen Sie 8 ml des Reaktionspuffers (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) in die Küvette.</li>
	<li>Befestigen Sie den QCM-Sensorchip am Oszillator und ziehen Sie den Arm des Oszillators nach unten, um den Chip in den Bei1000-Rpm-Gerührer gerührten Puffer einzutauchen.</li>
	<li>Beginnen Sie mit der Überwachung der QCM-Frequenz auf dem PC und warten Sie, bis das Sensorgramm auf etwa 3 Hz/min der Frequenzdrift gleicht.</li>
	<li>In jizieren Sie 8 l einer T7-Phagenbibliothek (1—2 × 1010 pfu/ml) in die Küvette (Endkonzentration: 1-2 × 107 pfu/ml) und markieren Sie den Injektionspunkt auf dem Sensor.</li>
	<li>Überwachen Sie die Frequenzreduktion, die durch die Bindung von T7-Phagen an das kleine Molekül verursacht wird, das 10 min auf der Goldelektrodenoberfläche immobilisiert ist.</li>
	<li>Stoppen Sie den QCM-Frequenzmonitor, lösen Sie den Sensorchip vom Oszillator und entfernen Sie den Puffer, indem Sie Luft blasen und/oder mit Tüchern ableiten.</li>
	<li>Legen Sie den Sensorchip in eine feuchte Petrischale und legen Sie die 20 L der Suspension von E. coli (BLT5615) (OD600 = 0,5—1,0 nach Schütteln bei 37 °C durch Zugabe von IPTG zu 1 mM) Wirtszellen in der Log-Phase auf die Goldelektrode ab.</li>
	<li>Schließen Sie den Deckel der Schale und bedecken Sie ihn mit Aluminiumfolie, um Licht zu blockieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Schale bei 37 °C für 30 min auf einem 96-Well-Mikroplattenmischer (1000-1500 Rpm) zur Verbesserung der Wiederherstellung der gebundenen T7 Phagen.</li>
	<li>Stellen Sie die 20 L der Lösung wieder her, und setzen Sie sie in 200 l LB-Medium aus. HINWEIS: Die in diesem Schritt erhaltenen Proben können bei 4 °C um eine Woche aufbewahrt werden.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Verdünnungsserie der Phagenlösung für plaque isolation und DNA-Sequenzierung nach dem allgemeinen Verfahren in der Herstelleranleitungbeschrieben 8,9.</li>
	<li>Wischen Sie die Goldelektrodenoberfläche mit einem Wattestäbchen ab, der mit 1% Natriumdodecylsulfat-Lösung getränkt ist.</li>
	<li>Waschen Sie die Goldoberfläche mit reinem Wasser aus der Waschflasche und entfernen Sie dann Wassertropfen, indem Sie Luft mit einer Spritze oder einem Luftstaubsauger blasen.</li>
	<li>Tropfen Sie 5 l Piranha-Lösung (Conc. H2SO4: 30% H2O2 = 3:1) auf die Goldoberfläche fallen und 5 min abgeben.</li>
	<li>Waschen Sie die Goldoberfläche wieder mit Wasser und trocknen Sie dann, indem Sie Luft blasen und/oder mit Tüchern ableiten.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.14 und 2.15. VORSICHT: Bereiten Sie die Piranha-Lösung unmittelbar vor der Anwendung vor. Verwenden Sie diese Flüssigkeit sorgfältig, da es eine sehr starke Säure ist. Die Behandlung über 5 min erodiert den Sensorchip.</li>
</ol>3. Bioinformatik-Analyse mit Rezeptorligand Contact (RELIC) Programmsuite (Abbildung 2)10,11
<ol><li>Entpacken Sie das eigenständige RELIC-Programm auf einem PC mit einem MS Windows-Betriebssystem.</li>
	<li>Richten Sie die Aminosäuresequenzen der 15-mer-Peptide-Affinitätsaffinität aus, die mit dem Medikament ausgewählt oder zufällig aus der nicht gescreenten übergeordneten Bibliothek in jeder Textformatdatei ausgewählt wurde (Name.txt).</li>
	<li>Geben Sie die Aminosäuresequenz einzelner oder mehrerer Proteine in jede Textdatei im FASTA-Format ein, oder laden Sie die Datenbanktextdateien im FASTA-Format aus einer beliebigen Proteindatenbank (z. B. UniProt (http://www.uniprot.org/) oder DrugBank (https://www.drugbank.ca/) herunter.</li>
	<li>Platzieren Sie die Textdateien (und PDB-Dateien für HETEROalign) in dem Ordner, der zum Ausführen jedes RELIC-Programms erforderlich ist.</li>
	<li>Klicken Sie im unabhängigen Ordner auf die ausführbare Datei (Programm.exe) für AADIV, INFO, MOTIF, MATCH, HETEROalign, FASTAcon und FASTAskan, um die persönliche Version von FTN95 zu öffnen.</li>
	<li>Geben Sie den entsprechenden Dateinamen zusammen mit der Erweiterung (Name.txt) in die Befehlsmeldung ein, um jedes Programm auszuführen und die erforderliche Textformatdatei abzuerhalten.</li>
	<li>Exportieren Sie die resultierende Textdatei in eine Tabellenkalkulationssoftware (z. B. Excel), um ein Diagramm mit Informationsinhalten (INFO) oder kumulativen Ähnlichkeitswerten zu generieren, die mit einem BLOSUM62 (MATCH, HETEROalign) berechnet wurden. HINWEIS: Der ursprüngliche RELIC-Server (http://relic.bio.anl.gov) ist nicht mehr verfügbar und einige eigenständige RELIC-Programme, die auf PCs mit einer Windows-Plattform funktionieren, können vom entsprechenden Autor (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp) bezogen werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+map+of+molecular+drug+targets.">A comprehensive map of molecular drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).</li><li>Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+for+small+bioactive+molecules:+finding+the+needle+in+the+haystack.">Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack.</a> Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).</li><li>Piggott, A. 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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Hier wurde eine Strategie für die QCM-Biosensien von arzneimittelerkennenden Peptiden vorgestellt, gefolgt von einer Bioinformatik-Analyse zur Validierung von Arzneimittel-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung der identifizierten Peptide. Die Entwicklung der kleinen Molekülderivate zur Immobilisierung auf der Goldelektrode des Biosensors ist ein wichtiger Schritt, da der eingeführte Linker die Bindung und Sammlung des Peptids, das das Medikament erkennt, behindern kann. Um dies zu vermeiden, werden Derivate mit unterschiedlichen Positionen des eingeführtenLinkers 23vorbereitet. Alternativ wird der Sensorchip zur Immobilisierung hydrophober kleiner Moleküle in massenhaftes Wasser in eine 10 cm Petrischale getaucht und eine 20-L-Lösung des kleinen Moleküls (10 mM Lösung in Dimethylsulfoxid) auf die Goldelektrode des Biosensors fallen, um seine Oberfläche zu bedecken, und für 5 min inkubiert. Dies ermöglicht die Retention einer intrinsischen Frequenz von kleinen Molekülen mit unter hundert Hertz, die während der Biopannierung mindestens 10 min gehalten wird. Tatsächlich haben die von Osel-Affinität ausgewählten Peptide mit einer solchen Immobilisierung die Osel-Bindungsstelle in NA deutlich hervorgehoben (Abbildung 3).
Der T7-Phagen, der hier für die Vorbereitung der Peptidbibliothek verwendet wird, ist gentechnisch verändert mit der NNK15 Kassette, die 32 Codons für alle 20 Standard-Aminosäuren kodiert und die Entstehung von 2 Stop-Codons (UAA, UGA) unterdrückt und nur UAG (Abbildung 1)6,7. Dies ist wichtig für die Anzeige von 15-mer-Peptiden in voller Länge und die Erhöhung der Vielfalt der Bibliothek. Das Phagenanzeigesystem T7 hat eine technische Anzeigegrenze von 107—109 T7 Phagen. Die Vielfalt der 15-mer-Peptidbibliothek beträgt jedoch theoretisch 2015 (3,27 × 1019); daher kann es nicht für den kompletten Bibliotheksbau verwendet werden. Dennoch ermöglicht die Ähnlichkeitssuche oder der Abbau konservierter Motive den Nachweis der Aminosäuren, die die wirkstoffbindenden Stellen von Proteinen umfassen, auch bei dieser begrenzten Vielfalt an Peptiden in der Bibliothek. Darüber hinaus sind 3-5 Aminosäure-Dehnungen innerhalb des Bibliothekspeptids (die Erscheinungsrate liegt zwischen 1/203 und 1/ 205, die mit dem T7-Phagenanzeigesystem realisiert werden kann) an der Erkennung kleiner Molekülmedikamente beteiligt; Daher ist eine 100%ige Übereinstimmung der Peptidsequenzen mit 15-mer-Aminosäuresequenzen, die die Wirkstoffbindungsstelle des Zielproteins bilden, nicht erforderlich. Tatsächlich haben etwa 30 affinitätsausgewählte Peptide erfolgreich die Bindungsstelle des Zielproteins für jedes getestete Medikament hervorgehoben (Abbildung 4). So kann die Vielfalt der verwendeten Elternbibliothek T7 (1,7 × 107 pfu/ml) genutzt werden, um die drogenbindende Stelle heuristisch zu rekonstruieren.
Typischerweise entstanden innerhalb der 16 Plaques willkürlich isolierte Kopien von T7-Phagen, die die gleichen Sequenzen wie die der 15-mer-Aminosäuresequenzen zeigten, die drogenerkennende Aminosäure-Strecken beherbergen. Dies deutet darauf hin, dass 18-30 verschiedene medikamentös erkennende Peptidsequenzen innerhalb der 96 Plaques isoliert werden (die Zahl ist mit dem Mikroplattenformat verbunden), die anschließend mittels Sequenzierung der DNA und der entsprechenden Aminosäuresequenz identifiziert werden. Nach der vorliegenden Strategie eignet sich die Injektion von 8 l der T7-Phagenbibliothek in die Küvette mit 8 ml Puffer (1000-fache Verdünnung der Bibliothek) zur Reduzierung der unspezifischen Bindung von T7-Phagen. Um die Vielfalt der affinitätsausgewählten Peptide zu erhöhen, erwies sich die mehrfache Wiederholung der Ein-Zyklus-Auswahl und die Verwendung von 16 oder 32 Plaqueisolationen pro Screening als effektiver als die Isolierung von einer einzigen Lösung zu einem Zeitpunkt. Um beispielsweise etwa 30 unterschiedlich sequenzierte, affinitätsausgewählte Peptide effektiv zu sammeln, wurden 3–6 Sätze von Ein-Zyklus-Auswahl durchgeführt, 16 oder 32 Plaques wurden in jedem Experiment isoliert. Das Auftreten identischer Sequenzen in allen 16 oder 32 T7 Phagen-Plaques ist auf eine versehentliche Erkennung des Hintergrunds oder eine Kontamination als Übertragung hindeutet. Im Gegensatz dazu deutet das Fehlen von T7-Phagen mit der gleichen Reihenfolge oder Erscheinung vieler T7-Phagen mit kürzeren Peptiden als die 15-mer-Länge darauf hin, dass T7-Phagen in der Population nicht spezifisch mit hoher Wahrscheinlichkeit entstanden sind. Da die QCM-Frequenzreduktion auch in solchen Fällen im gleichen Ausmaß erfolgt, sollte der Erfolg der Selektion umfassend bewertet werden, indem die DNA des isolierten T7-Phagens sequenziert wird, gefolgt von einer bioinformatischen Analyse der Aminosäuresequenzen der Peptide. Darüber hinaus sind im Gegensatz zum herkömmlichen T7-Phagenanzeigeprotokoll wiederholte Selektionsrunden weniger effektiv, da die Variation und Anzahl der T7-Phagen klein sind und auch nach Wiederholung der Verstärkungs- und Selektionsschritte23nicht konzentriert sind.
Wichtig ist, dass diese Methode für den Abbau kleiner Molekül-bindender Stellen in den Proteomen von Menschen, pathogenen Viren und sogar Pflanzen anwendbar ist. Interessanterweise kann die möglicherweise unstrukturierte kurze Anzeigelänge von Peptiden auf dem T7-Phagenkapsid die molekulare Dynamik von Peptiden von Proteinen während des Andockens mit einem kleinen Molekül imitieren; dies kann die dynamische Bindung24widerspiegeln. Über die technischen Grenzen konventioneller Methoden hinaus kann diese Strategie, die auf identische Protokolle für kleine Moleküle anwendbar ist, das medikamentöse Proteom erweitern und eine größere Granularität in Bezug auf die Wirkstoff-Protein-Interaktionsanalyse bieten.
Bestimmte technische Einschränkungen dieses Ansatzes sollten in Betracht gezogen werden. Die organische Synthese ist für die kleine Molekülimmobilisierung auf der Goldelektrodenoberfläche des Biosensorchips notwendig. Für die Nicht-Experten in der organischen Chemie sind einige Immobilisierungsreagenzien kommerziell erhältlich, um das kleine Molekül durch Kopplung mechanisch zu fixieren. Darüber hinaus können bestimmte Unsinnsanteile der Peptide dazu führen, dass ein Teil des Proteins, der für das Drogendocken nicht relevant ist, als falsch positive Werte nachweisbar ist. Dies entspricht empirisch Beta-Blatt- oder Leucin-reichen Domänen reich an Leucin- oder Valin-Rückständen, die bei der Herstellung von Kopien des T7-Phagens durch mehr Codons als andere Standard-Aminosäuren kodiert werden. Die Steuerung der Bibliothekspeptidlänge kann das Auftreten falschpositiver Positivmeldungen steuern. Im Gegensatz dazu kann es Fälle geben, in denen Aminosäurerückstände an der Wirkstoffbindungsstelle, die am Andocken beteiligt sind, wie mit Röntgenkristallographie oder NMR-Analyse nachgewiesen, nicht nachgewiesen werden. Dies kann gelöst werden, indem eine größere Anzahl der arzneimittelerkennenden Peptide gesammelt oder die Richtung der Fixierung der kleinen Moleküle auf der Goldelektrode geändert wird.
Viele Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Proteinen, die mit den Haupt- und Sekundärwirkungen des Drogenkonsums zusammenhängen, können im Proteom noch nicht identifiziert werden; Außerdem könnten Enzyme und Transporter, die für die Wirkstoffaufnahme, -verteilung, -stoffwechsel, -ausscheidung und -toxizität verantwortlich sind, ebenfalls noch nicht identifiziert werden. Proteinbindung ist nicht immer verantwortlich für die Bioaktivität eines Arzneimittels. So wird eine Kombination anderer Informationen aus biologischen Assays die Identifizierung wesentlicher Arzneimittelziele verbessern, die für die wichtigsten und nachteiligen Auswirkungen von Arzneimitteln verantwortlich sind. Weitere Anpassungen dieser prägnanten Technik werden die Praktikabilität und den Durchsatz für den Abbau der Proteinbindungsstellen einer breiten Palette kleiner Molekülmedikamente erhöhen. Die hier vorgestellte Methode wird weitgehend dazu beitragen, nicht nur Grundlagenforschungen in den verwandten Bereichen durchzuführen, sondern auch die molekularen Mechanismen zu klären, die der therapeutischen Wirksamkeit oder anderen biologischen Wirkungen von Arzneimitteln im klinischen Einsatz zugrunde liegen.

Die Identifizierung von medikamentenbindenden Zielen ist ein wesentlicher Bestandteil für die Entwicklung von Medikamenten sowie für das Verständnis der molekularen Mechanismen von Krankheiten. Insbesondere Rezeptor- und Enzymproteine sind die wichtigsten molekularen Ziele bioaktiver kleiner Moleküle1. Obwohl Affinitätserfassung eine etablierte Technik zur Identifizierung der arzneimittelbindenden Proteine2ist, behindern technische Einschränkungen, wie z. B. die geringe Löslichkeit von Proteinen, oft die Validierung von Wirkstoffzielen2. Am wichtigsten ist, dass die immobilisierten kleinen Moleküle den für das Andocken notwendigen Freiheitsgrad verlieren und für die intern lokalisierten Bindungsstellen auf größeren Zielproteinen unzugänglich sein können. Darüber hinaus behindern Proteinfehlfaltung, Unfähigkeit, Kokristallisationsbedingungen zu analysieren, und Einschränkungen aufgrund molekularer Größe häufig die Verwendung von Röntgenkristallographie, Kernspinresonanz (NMR) und anderen solchen experimentellen Analysen zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Proteinen.
Die Verwendung des T7 Phagen-Display-Biopannings ist eine effiziente Möglichkeit, die Bindungsstelle auf Proteinen für kleine Molekülköder zu bestimmen3. Insbesondere eine vom T7-Phagen angezeigte zufällige Peptidbibliothek, die durch Einsetzen synthetischer DNA in eine Multiklonierungsstelle aufgebaut werden kann, ist wirksam. Im Vergleich zur T7-Phagenbibliothek, die Proteine anzeigt, können die kurzen Peptide ohne physikalische Einschränkungen einfach auf dem T7-Phagenkapsid angezeigt werden, das sterisch mit jedem kleinen Molekül-Medikament in Berührung kommen kann, das auf einer festen Stütze fixiert ist2. Darüber hinaus ermöglicht die Einführung eines Quarz-Kristall-Mikrobilanz-Biosensors (QCM) in die Biopanning-Plattform t7-Phagendisplay die Identifizierung solcher schwachen, aber spezifischen Wechselwirkungen von kurzen Peptiden mit Medikamenten durch Überwachung der Reduzierung der QCM-Frequenz4,5. Der gebundene T7-Phagen wird dann direkt durch Infizierung des Wirts Escherichia coli (BLT5615) wiederhergestellt, und die DNA-Sequenz der Region, die das affinitätsausgewählte Peptid kodiert, das drogenerkennende Kurzsegmente beherbergt, wird bestimmt. Die nachfolgende Analyse der Aminosäuresequenz der Peptidpopulation liefert Informationen zur Arzneimittelerkennung. In silico paarweise Ausrichtung der geretteten AminosäureSequenzen können verwendet werden, um Informationen über das biologische Ziel des Medikaments innerhalb eines ausgewählten Proteomzuerhaltens zu erhalten. Diese hohe Durchsatzidentifikation von Proteinfragmenten mit Affinität zu einem Medikament kann verwendet werden, um die drogenbindende Stelle heuristisch zu rekonstruieren, ähnlich wie die Rekonstruktion eines alten Artefakts aus Keramikscherben6. Insbesondere kann dieser einzigartige Ansatz nützlich sein, wenn herkömmliche Proteomik-Ansätze fehlschlagen.
Hier stellen wir eine biosensorbasierte Strategie zur Biopannierung von T7-Phagen-Peptiden und Bioinformatik-Analysen zur Zielvalidierung der kleinen Moleküle vor. Über die technischen Beschränkungen konventioneller Methoden hinaus ermöglicht diese Strategie die Identifizierung von Wirkstoffbindungsstellen auf Zielproteinen für jedes kleine Molekül von Interesse nach dem identischen Protokoll.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFFINIXQN</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCM2008-STKIT</td>
			<td>Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AADIV</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>AADIV.exe</td>
			<td>Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Sensor Chip</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMST27C</td>
			<td>4 sensor chips/package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>09-0850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAcon</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAcon.exe</td>
			<td>Identifies proteins from a population with short consensus sequences.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAskan</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAskan.exe</td>
			<td>Lists proteins with high similarity to a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immiblization kit for AFFINIX</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMIMKT</td>
			<td>SAM reagent and amine coupling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFO</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>INFO.exe</td>
			<td>Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liguid LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Autoclave for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATCH</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MATCH.exe</td>
			<td>Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5&#8211;6 amino acids in length).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF1</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF1.exe</td>
			<td>Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF2</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF2.exe</td>
			<td>Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recptor ligand contacts (RELIC)</td>
			<td>Argonne National Laboratory 
			(Lemont, IL, USA)</td>
			<td>https://www.relic.anl.gov</td>
			<td>Currently unavailable 
			(Stand-alone program can be used from correspondence author upon request)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions

Rezeptoren und Enzymproteine sind wichtige Biomoleküle, die als Bindungsziele für bioaktive kleine Moleküle fungieren. Daher ist die schnelle und globale Validierung der Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Protein enden sehr wünschenswert, um nicht nur die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der therapeutischen Wirksamkeit zugrunde liegen, sondern auch für die Bewertung von Arzneimittelmerkmalen wie Adsorption, Verteilung, Stoffwechsel, Ausscheidung und Toxizität (ADMET) für den klinischen Einsatz. Hier stellen wir eine biosensorbasierte Hochdurchsatzstrategie für die Biopannierung von T7-Phagen-angezeigten kurzen Peptiden vor, die leicht auf dem Phagendeckel angezeigt werden können. Eine nachträgliche Analyse der Aminosäuresequenzen von Peptiden, die kurze Segmente enthalten, als "gebrochene Relikte", der arzneimittelbindenden Stellen mit Bioinformatik-Programmen in der Rezeptligaand-Kontakt-Suite (RELIC) gezeigt. Durch die Anwendung dieser Methode auf zwei klinisch zugelassene Medikamente, einen Anti-Tumor-Irinotecan und ein Anti-Grippe-Oseltamivir, wird der detaillierte Prozess zum Sammeln der arzneimittelerkennenden Peptidsequenzen und zur Hervorhebung der wirkstoffbindenden Stellen der Zielproteine in diesem Papier erläutert. Die hier beschriebene Strategie kann für alle kleinen Moleküle von Interesse angewendet werden.

Die repräsentativen Ergebnisse für zwei klinisch zugelassene Medikamente sind in Abbildung 3dargestellt. Irinotecan (Abbildung 3A), ein wasserlösliches Prodrug des natürlichen Camptothecins zur Behandlung von fortgeschrittenem Dickdarmkrebs und nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, wird in der Leber in SN-38 umgewandelt, was Topoisomerase I in Krebszellen12hemmt. Darüber hinaus hemmt diese Verbindung direkt Acetylcholinesterase (AChE)13,14. Durch die Strategie wurden 29 Peptide, die Iri als SAM immobilisiert erkannten, von QCM-Biosensor-basierten Ein-Zyklus-Biopanning-Teilmengen identifiziert. Die anschließende paarweise Ausrichtung der 29 Peptide und AChE ergab maximale Werte für Y121, Q225, F290, E327, H440 und Y442 und hob den Teil in der dreidimensionalen Struktur hervor. Diese Aminosäurerückstände stimmten mit denen überein, die die Iri-bindende Stelle von AChE ausmachten. Dieselbe Untergruppe von Peptiden identifizierte erfolgreich E99, L100, L252, L305, I387 und V474 in der Nähe der katalytischen Triade (S221, E353 und H467) in carboxylesterase (CE), was darauf hindeutet, dass diese Aminosäuren ein Gerüst zur Iri-Erkennung bei der Esterung von Iri15bilden. Solche Aminosäurerückstände an der katalytischen Stelle können nicht direkt mit konventioneller Röntgenkristallographie oder NMR-Analyse identifiziert werden, da die Enzymreaktion reibungslos verläuft und den statischen Komplex unter allgemeinen experimentellen Bedingungen nicht stabil bildet. Somit ist der kombinatorische Nachweis von medikamentenbindenden Stellen mehrerer Proteine, einschließlich der in den Zwischenkomplexen, die möglicherweise mit Enzymen während der Stoffwechselreaktionen für ein bestimmtes Medikament gebildet werden, mit den für ein Medikament bestimmten Affinitäts-ausgewählten Peptiden möglich.
Abbildung 3B zeigt die anderen Ergebnisse für Oseltamivir (Osel), ein Anti-Grippe-Medikament, das gegen Oseltamivircarboxylat aktiviert wird, das wiederum die Neuraminidase (NA) des Influenzavirus16hemmt. Die 27 Peptide, die Osel auf der QCM-Sensorchip-Goldelektrodenoberfläche erkannten, erkannten erfolgreich die Osel-Bindungsstelle in NA16. Diese Bindungsstelle besteht aus unstrukturierten Peptidschleifen, die beim Andocken mit Osel möglicherweise einer dynamischen Bewegung unterzogen werden. Die Osel-erkennenden Peptide auf dem T7-Phagen-Capsid könnten dieses dynamische Andocken imitieren, wenn sie an die Osel-Basierte an der Goldelektrodenoberfläche des QCM-Sensorchips binden. Neuropsychiatrische Nebenwirkungen (NPAEs) wurden bei jungen Patienten mit Influenza identifiziert, die möglicherweise mit der Krankheit selbst und nicht mit dem Medikament zusammenhängen. Studien haben gezeigt, dass Osel aktiv aus dem zentralnervösen System (ZNS) von Nagetieren über Multidrug Resistance (MDR) Protein in der Blut-Hirn-Schranke (BBB)17exportiert wird. Tatsächlich zeigte eines der Proteine der Klasse dieser MDR in unserer Studie einen hohen Wert (Top 5% von 4.396 in der DrugBank 1.0 Proteindatenbank18), zusätzlich zu anderen Transportern, Neurotransmitter-bezogenen Enzymen und Rezeptoren. Die pharmakologische Bedeutung dieser Proteine im Hinblick auf das Auftreten von Nebenwirkungen von Osel wird untersucht.
Bisher wurden einzelne und mehrere kleine Molekülbindungsstellen an den Zielproteinen erfolgreich für sechs kleine Molekülmedikamente identifiziert, die unsere Strategie nutzten (Abbildung 4). Für Brz2001 und Roxithromycin (RXM) wurden identische Wirkstoffbindungsstellen auf einem Zielprotein mit verschiedenen Peptidenpools identifiziert, deren Anzahl und Aminosäuresequenzen vollständig variierten7,19. Darüber hinaus führten einzelne Peptidpools für Iri, RXM und Osel zur Identifizierung mehrerer Bindungsstellen an verschiedenen Proteinen für jedes Medikament, wie AChE und CE für Iri (Abbildung 3A)20, Angiomotin und CYP3A4 für RXM19,21und NA und MDR-assoziiertes Protein für Osel. Für die Anti-Tumor-Verbindung Doxorubicin (FANCF)22und das antiangiogene Makrolid-Antibiotikum RXM (Angiomotin)19wurde ein unbekanntes molekulares Ziel identifiziert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der QCM-Biosensor-basierten Biopannierung der T7-Phagen-angezeigten Peptidbibliothek. Eine T7-Phagenbibliothek, die zufällige Peptide anzeigt, wird in die Küvette injiziert, die den Puffer (unter Rühren) enthält, in den der QCM-Biosensorchip getaucht und die Frequenz stabilisiert wird. Nach der Überwachung der Frequenzreduktion durch Bindung von T7-Phagen an kleine Moleküle, die auf der Goldelektrodenoberfläche des Sensorchips immobilisiert sind, wird der Sensorchip vom Oszillator abgetrennt. DIE DNA aus dem gebundenen T7-Phagen wird dann nach einer E. coli-Infektion (BLT5615) direkt wiederhergestellt. Die resultierenden T7-Phagen werden über Plaquebildung isoliert und schließlich wird die Aminosäuresequenz des auf dem T7-Phagenkapsid angezeigten Wirkstoffaffinitäts-ausgewählten Peptids nach der allgemeinen Phagenanzeigemethode bestimmt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Schematische Darstellung der quantitativen Bewertung des Sequenzvergleichs zwischen medikamentös ausgewählten Peptiden und einzelnen oder mehreren Proteinen. Die medikamentös ausgewählten Peptidsequenzen werden jeweils an den primären Aminosäuresequenzen einzelner und mehrerer Proteine ausgerichtet, und die Ähnlichkeit in jedem 3-5 Aminosäure-Set wird kumulativ über eine paarweise Ausrichtung gemäß einer modifizierten BLOSUM62-Matrix bewertet. Das resultierende Diagramm zeigt die Rückstände oder Portionen an, die eine potenzielle wirkstoffbindende Stelle auf dem Protein darstellen. Eine weitere Analyse mit einem entsprechenden RELIC-Programm hebt die Bindungsseite auf der dreidimensionalen Struktur hervor (falls PDB-Datei verfügbar ist) oder ordnet ganze Proteine ein, die möglicherweise das Bindungsziel sind (HETEROalign-Programm ist derzeit nicht verfügbar). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse der Peptidsammlung und der anschließenden Bioinformatikanalyse. (A) Irinotecan (Anti-Tumor-Prodrug, Topoisomerase-I-Hemmer). Die T7-Phagen-Interaktion wurde 10 min lang als Verringerung der QCM-Frequenz überwacht. Die DNA des gebundenen T7-Phagens wurde zurückgewonnen und sequenziert, um die entsprechende Aminosäuresequenz zu bestimmen. Die Aminosäuresequenzen von 29 15-mer Peptiden, die mit einer Teilmenge der Ein-Zyklus-Biopanning gesammelt wurden, hoben die Aminosäuren hervor, aus denen die Iri-bindungsstelle von AChE besteht [PDB ID 1U65]. Eine weitere Bewertung mit den gleichen 29 Peptiden zeigte die benachbarten Aminosäurerückstände (Gerüstrückstände zur Entesterung) der katalytischen Triade in CE, einem Leberenzym, das Iri in SN-38 (aktive Form) umwandelt [PDB-ID: 1K4Y]. Ähnlichkeitswerte von 103 zufällig ausgewählten Peptiden aus der nicht gescreenten übergeordneten Bibliothek7,19 wurden von diesen Partituren subtrahiert, um Bibliotheksverzerrungen zu entfernen. Diese Zahlen stammen aus Ref. 20, mit Genehmigung von Elsevier. (B) Oseltamivir (Anti-Grippe-Medikament). Die 27 Peptide, die Osel-erkennende Aminosäuren enthielten, zeigten ungeordnete Teile der Osel-Bindungsstelle für Neuraminidase (NA) (Virusenzym) [PDB ID: 2HT7]. Die globale Validierung der Sequenzähnlichkeit zwischen 27 Peptiden und 4.396 Proteinen in DrugBank 1.018 ergab, dass NA im oberen Bereich von 5% liegt, zusätzlich zu den menschlichen Wirtsproteinen, die mit den Funktionen des zentralen Nervensystems verbunden sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig4v2.jpg"> Abbildung 4:Zusammenfassung derkleinen Moleküle, deren Bindungsziele mit dieser Strategie identifiziert wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Diese Studie zielte darauf ab, eine Strategie zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Peptid zu präsentieren. Die Strategie umfasst die Biopanierung von medikamentenerkennenden kurzinomischen Kurzpeptiden auf der Grundlage eines Mikrobilanzsensors (QCM) in Quarzkristall, gefolgt von einer Bioinformatik-Analyse zur quantitativen Bewertung der für die Arzneimittelerkennung und Anmerkung der Arzneimittelbindungsstellen auf Proteinen erhaltenen Informationen.

Biosensor-basierte Hochdurchsatz-Biopanning- und Bioinformatik-Analysestrategie zur globalen Validierung von Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Proteinen

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

biosensor-based-high-throughput-biopanning-bioinformatics-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.9K Aufrufe.  National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology. Diese Studie zielte darauf ab, eine Strategie zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Peptid zu präsentieren. Die Strategie umfasst die Biopanierung von medikamentenerkennenden kurzinomischen Kurzpeptiden auf der Grundlage eines Mikrobilanzsensors (QCM) in Quarzkristall, gefolgt von einer Bioinformatik-Analyse zur quantitativen Bewertung der für die Arzneimittelerkennung und Anmerkung der Arzneimittelbindungsstellen auf Proteinen erhaltenen In...

Serie: Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

Zellbasierte Calcium-Assay für Mittel-bis High-Throughput-Screening von TRP-Kanal-Funktionen mit FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Forschung

Biotechnik

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Bestimmung der Transport von Xenobiotika und Nanomaterialien über die Plazenta mit dem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menschliche Plazentaperfusion Modell

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

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There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

High Speed ​​Unter GHz-Spektrometer für Brillouin-Streuung Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...