Yazar, oseltamivir sağladıkları için Dr. Yujiro Hayashi ve Hayato Ishikawa'ya ve bağımsız RELIC programlarını sağladıkları için Dr. Lee Makowski'ye teşekkür ediyor. Yazar ayrıca Tetsuya Kawagoe'yi QCM deneyinin teknik yardımı için kabul ediyor. Bu çalışma JSPS KAKENHI Grant Number 17K01363 (Y.T.) tarafından kısmen desteklendi.
VERI KULLANıLABILIRLIĞI BILDIRIMI
Tek başına RELIC programları ve ilaçlar için benzeşim tarafından seçilen peptitlerin sıra verileri ve bu makalede kullanılan proteom veritabanındaki protein dizileri talep üzerine bu yazardan edinilebilir (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).

NOT: Aşağıda, bir QCM biyosensörü kullanarak uyuşturucu tanıyan T7 fajlarının taranıp E. coli (BLT5615) enfeksiyonu yoluyla taranan fajların kurtarılması için adımlar yer bunların altı çizilmiştir. Kendi kendine monte edilmiş bir monolayer (SAM) oluşturan küçük bir molekülün türevinin sentezi ve T7 fajla görüntülenen 15 mer rastgele peptit kütüphanesinin inşası için protokoller başka bir yerde bulunabilir6,7.
1. QCM sensör çipinin hazırlanması
<ol><li>27 MHz'lik bir QCM cihazının osilatörüne seramik bir sensör çipi takın ve küçük molekül hareketsizleştirmeden önce iç frekansı (Hz) hava fazına kaydedin.</li>
	<li>Çipi ayırın ve bir pipet kullanarak sensör çipinin altın elektrodu üzerine SAM oluşturan küçük bir molekül türevinin 20 μL çözeltisini (%70 etanolde 1 mM) bırakın. DİkKAT: Altın elektrodun (Au, 0,1 mm kalınlığında, 2,5 mm i.d., 4,9 mm2)bulunduğu sensör çip kristali son derece incedir ve kolayca çatlayabilir (SiO2, 0,06 mm kalınlığında, 9 mm i.d.). Bu nedenle, pipet dikkatlice.</li>
	<li>Nemlendirilmiş dokuya sahip ve oda ışıklarından korumalı bir Petri kabında oda sıcaklığında (yaklaşık 20 °C) 1 saat bekletin.</li>
	<li>Elektrot yüzeyini ultra saf su ile hafifçe yıkayın; ardından, bir şırınna veya hava tozlayıcı ile hava üfleyerek su damlalarını çıkarın.</li>
	<li>QCM aparatı için sensör çipini kurun ve hareketsiz hale getirilen küçük molekülün miktarını ölçmek için hava fazında frekanstaki azalmayı kaydedin. NOT: Başarılı küçük molekül hareketsizleştirme için en az 100 Hz iç frekans gereklidir (1 Hz 30 pg'yi hareketsizleştirir).</li>
</ol>2. T7 faj kütüphanesinin QCM biyosensör kullanılarak biyopanningi (Şekil 1)
<ol><li>QCM biyosensörde özel bir manyetik karıştırıcı ile bir cuvette ayarlayın ve reaksiyon tamponunun 8 mL'lik kısmını (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) cuvette'e dökün.</li>
	<li>QCM sensör çipini osilatöre takın ve çipi 1000 rpm'de karıştırılan tampona batırmak için osilatörün kolunu aşağı çekin.</li>
	<li>Kişisel bilgisayarda (PC) QCM frekansını izlemeye başlayın ve sensorgram frekans kaymasının yaklaşık 3 Hz / dakikasına kadar eşdeğer olana kadar bekleyin.</li>
	<li>Cuvette'e 8 μL T7 faj kütüphanesi (1-2 ×10 10 pfu/mL) enjekte edin (son konsantrasyon: 1-2 ×10 7 pfu/mL) ve sensördeki enjeksiyon noktasını işaretleyin.</li>
	<li>T7 fajlarının altın elektrot yüzeyinde hareketsiz hale getirilen küçük moleküle bağlanmasının neden olduğu frekans azaltmayı 10 dakika boyunca izleyin.</li>
	<li>QCM frekans monitörünü durdurun, sensör çipini osilatörden çıkarın ve havayı üfleyerek ve/veya mendillerle fitilleyerek tamponu çıkarın.</li>
	<li>Sensör çipini nemli bir Petri kabına yerleştirin ve kütük fazındaki 1 mM'ye IPTG ekleyerek 37 °C'de sallayarak E. coli (BLT5615) (OD600 = 0.5—1.0) süspansiyonunun 20 μL'lik süspansiyonunu altın elektrot üzerine bırakın.</li>
	<li>Kabın kapağını kapatın ve ışığı engellemek için alüminyum folyo ile örtün.</li>
	<li>Bağlı T7 fajlarının geri kazanımını artırmak için kabı 96 kuyulu bir mikro plaka karıştırıcıda (1000-1500 rpm) 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Çözeltinin 20 μL'lik kısmını geri alın ve 200 μL LB ortasına askıya alın. NOT: Bu adımda elde edilen numuneler 4 °C'de bir hafta korunabilir.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarında açıklanan genel prosedüre göre plak izolasyonu ve DNA dizilimi için faj çözeltisinin bir seyreltme serisini hazırlayın8,9.</li>
	<li>Altın elektrot yüzeyini% 1 sodyum dodecyl sülfat çözeltisi ile ıslatılmış bir pamuklu çubukla silin.</li>
	<li>Altın yüzeyi yıkama şişesinden ultra saf su ile yıkayın ve ardından bir şırınna veya hava tozlayıcı ile hava üfleyerek su damlalarını çıkarın.</li>
	<li>Altın yüzeye 5 μL piranha çözeltisi (Conc. H2SO4: %30 H2O2 = 3:1) bırakın ve 5 dakika bekletin.</li>
	<li>Altın yüzeyi tekrar suyla yıkayın ve ardından hava üfleyerek ve/veya mendillerle fitilleyerek kurulayın.</li>
	<li>2.14 ve 2.15. DİkKAT: Piranha çözeltisini kullanmadan hemen önce hazırlayın. Çok güçlü bir asit olduğu için bu sıvıyı dikkatli kullanın. 5 dakikadan uzun süre tedavi sensör çipini aşındırır.</li>
</ol>3. Reseptör Ligand Contact (RELIC) program paketi kullanılarak biyoinformatik analizi (Şekil 2)10,11
<ol><li>MS Windows işletim sistemine sahip bir bilgisayarda tek başına RELIC programını açın.</li>
	<li>İlacı kullanarak seçilen veya her metin formatı dosyasındaki (ad.txt) ekransız üst kitaplıktan rastgele seçilen 15 mer peptit benzeşiminin amino asit dizilerini hizalayın.</li>
	<li>Fasta formatında her metin dosyasına tek veya birden çok proteinin amino asit dizisini yazın veya veritabanı metin dosyalarını fasta formatında herhangi bir protein veritabanından (örneğin UniProt (http://www.uniprot.org/) veya DrugBank (https://www.drugbank.ca/) indirin.</li>
	<li>Metin dosyalarını (ve HETEROalign için PDB dosyalarını) her RELIC programını çalıştırmak için gerekli klasöre yerleştirin.</li>
	<li>FTN95'in Kişisel Sürümünü açmak için bağımsız klasörde AADIV, BİlGİ, MOTIF, MATCH, HETEROalign, FASTAcon ve FASTAskan için yürütülebilir dosyayı (program.exe) tıklatın.</li>
	<li>Her programı yürütmek ve gerekli metin biçimi dosyasını edinmek için komut iletisine uzantı (ad.txt) ile birlikte uygun dosya adını yazın.</li>
	<li>Blosum62 (MATCH, HETEROalign) kullanılarak hesaplanan bilgi içeriği (INFO) veya kümülatif benzerlik puanlarının bir grafiğini oluşturmak için elde ettiği metin dosyasını bir elektronik tablo yazılımına (örneğin, Excel) verin. NOT: Özgün RELIC sunucusu (http://relic.bio.anl.gov) artık kullanılamıyor ve Windows platformuna sahip bilgisayarlarda çalışan bazı bağımsız türde RELIC programları ilgili yazardan (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp) edinilebilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+map+of+molecular+drug+targets.">A comprehensive map of molecular drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).</li><li>Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+for+small+bioactive+molecules:+finding+the+needle+in+the+haystack.">Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack.</a> Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).</li><li>Piggott, A. M., Karuso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+cellular+targets+of+natural+products+using+T7+phage+display.">Identifying the cellular targets of natural products using T7 phage display.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 626-636 (2016).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sakaguchi, K., Sugawara, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology+for+target+determination+of+small-molecule+therapeutics:+an+update.">Phage display technology for target determination of small-molecule therapeutics: an update.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (10), 1199-1211 (2020).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+phage+display+technology+for+the+determination+of+the+targets+for+small-molecule+therapeutics.">Use of phage display technology for the determination of the targets for small-molecule therapeutics.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (4), 361-389 (2010).</li><li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+QCM+Biosensor-Based+T7+Phage+Display+Combined+with+Bioinformatics+Analysis+for+Target+Identification+of+Bioactive+Small+Molecule.">Using the QCM Biosensor-Based T7 Phage Display Combined with Bioinformatics Analysis for Target Identification of Bioactive Small Molecule.</a> Methods in Molecular Biology. 1795, 159-172 (2018).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+a+disordered+portion+of+the+Brz2001-binding+site+on+a+plant+monooxygenase,+DWARF4,+using+a+quartz-crystal+microbalance+biosensor-based+T7+phage+display.">Mapping a disordered portion of the Brz2001-binding site on a plant monooxygenase, DWARF4, using a quartz-crystal microbalance biosensor-based T7 phage display.</a> ASSAY and Drug Devevelopment Technologies. 11 (3), 206-215 (2013).</li><li>Novagen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+Select&#174;+System+Manual.">T7 Select&#174; System Manual.</a> Novagen. , (2009).</li><li>Novagen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrientExpressTM+cDNA+Manual.">OrientExpressTM cDNA Manual.</a> Novagen. , (2009).</li><li>Mandava, S., Makowski, L., Devarapalli, S., Uzubell, J., Rodi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELIC--a+bioinformatics+server+for+combinatorial+peptide+analysis+and+identification+of+protein-ligand+interaction+sites.">RELIC--a bioinformatics server for combinatorial peptide analysis and identification of protein-ligand interaction sites.</a> Proteomics. 4 (5), 1439-1460 (2004).</li><li>Makowski, L., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phage Nanobiotechnology. , 33-54 (2011).</li><li>Garcia-Carbonero, R., Supko, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+on+the+clinical+experience,+pharmacology,+and+continued+development+of+the+camptothecins.">Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 641-661 (2002).</li><li>Harel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+complex+of+the+anticancer+prodrug+7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin+(CPT-11)+with+Torpedo+californica+acetylcholinesterase+provides+a+molecular+explanation+for+its+cholinergic+action.">The crystal structure of the complex of the anticancer prodrug 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin (CPT-11) with Torpedo californica acetylcholinesterase provides a molecular explanation for its cholinergic action.</a> Molecular Pharmacology. 67 (6), 1874-1881 (2005).</li><li>Dodds, H. M., Rivory, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+for+the+inhibition+of+acetylcholinesterases+by+irinotecan+(CPT-11).">The mechanism for the inhibition of acetylcholinesterases by irinotecan (CPT-11).</a> Molecular Pharmacology. 56 (6), 1346-1353 (1999).</li><li>Bencharit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+CPT-11+activation+by+mammalian+carboxylesterases.">Structural insights into CPT-11 activation by mammalian carboxylesterases.</a> Nature Structural Biology. 9 (5), 337-342 (2002).</li><li>Kim, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+neuraminidase+inhibitors+possessing+a+novel+hydrophobic+interaction+in+the+enzyme+active+site:+design,+synthesis,+and+structural+analysis+of+carbocyclic+sialic+acid+analogues+with+potent+anti-influenza+activity.">Influenza neuraminidase inhibitors possessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site: design, synthesis, and structural analysis of carbocyclic sialic acid analogues with potent anti-influenza activity.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (4), 681-690 (1997).</li><li>Hoffmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+pharmacokinetics+of+oseltamivir+and+oseltamivir+carboxylate+in+the+central+nervous+system.">Nonclinical pharmacokinetics of oseltamivir and oseltamivir carboxylate in the central nervous system.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4753-4761 (2009).</li><li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DrugBank+5.0:+a+major+update+to+the+DrugBank+database+for+2018.">DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 1074-1082 (2018).</li><li>Takakusagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+biopanning+of+T7+phage-displayed+peptides+reveals+angiomotin+as+a+potential+receptor+of+the+anti-angiogenic+macrolide+Roxithromycin.">Multimodal biopanning of T7 phage-displayed peptides reveals angiomotin as a potential receptor of the anti-angiogenic macrolide Roxithromycin.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 809-821 (2015).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-cycle+affinity+selection+of+binding+proteins+or+peptides+specific+for+a+small-molecule+using+a+T7+phage+display+pool.">Efficient one-cycle affinity selection of binding proteins or peptides specific for a small-molecule using a T7 phage display pool.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (22), 9837-9846 (2008).</li><li>Takakusagi, Y., Suzuki, A., Sugawara, F., Kobayashi, S., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayer+(SAM)+of+small+organic+molecule+for+efficient+random-peptide+phage+display+selection+using+a+cuvette+type+quartz-crystal+micobalance+(QCM)+device.">Self-assembled monolayer (SAM) of small organic molecule for efficient random-peptide phage display selection using a cuvette type quartz-crystal micobalance (QCM) device.</a> World Journal of Engineering. 5, 1005-1006 (2009).</li><li>Kusayanagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+agent+doxorubicin+binds+to+Fanconi+anemia+group+F+protein.">The antitumor agent doxorubicin binds to Fanconi anemia group F protein.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 20 (21), 6248-6255 (2012).</li><li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+C10+biotinylated+camptothecin+(CPT-10-B)+binding+peptides+using+T7+phage+display+screen+on+a+QCM+device.">Identification of C10 biotinylated camptothecin (CPT-10-B) binding peptides using T7 phage display screen on a QCM device.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 15 (24), 7590-7598 (2007).</li><li>Rodi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+molecule+binding+sites+within+proteins+using+phage+display+technology.">Identification of small molecule binding sites within proteins using phage display technology.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 4 (7), 553-572 (2001).</li></ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Burada, ilaç tanıyan peptitlerin QCM biyosensör bazlı biyopannlaması için bir strateji ve ardından tanımlanan peptitleri kullanarak ilaç-protein etkileşimlerini doğrulamak için biyoinformatik analizi sunulmuştur. Biyosensörün altın elektrodu üzerinde hareketsizleştirme için küçük molekül türevlerinin tasarlanması önemli bir adımdır, çünkü tanıtılan bağlayıcı ilacı tanıyan peptitin bağlanmasını ve toplanmasını engelleyebilir. Bunu önlemek için, tanıtılan bağlayıcının farklı pozisyonlarına sahip türevler hazırlanır23. Alternatif olarak, hidrofobik küçük molekülleri hareketsiz hale getirmek için, sensör çipi 10 cm Petri kabında dökme suya batırılır ve küçük molekülün 20 μL çözeltisi (dimetil sülfitte 10 mM çözeltisi) biyosensörün altın elektroduna, yüzeyini örtmek için bırakılır ve 5 dakika boyunca inkübe edilir. Bu, biyopannlama sırasında en az 10 dakika tutulan küçük moleküllerin yüz altı hertz iç frekansının tutulmasına izin verir. Gerçekten de, bu tür hareketsizleştirmeyi kullanarak, Osel benzeşimi tarafından seçilen peptitler, NA'daki Osel bağlama bölgesini açıkça vurgulamıştır (Şekil 3).
Buradaki peptit kütüphanesini hazırlamak için kullanılan T7 fajı, standart amino asitlerin 20'si için 32 kodon kodlayan ve 2 stop kodonunun (UAA, UGA) ortaya çıkışını bastıran ve sadece UAG ( Şekil 1 ) 6,7ortaya çıkan NNK15kaseti kullanılarak genetik olarak tasarlanmıştır. Bu, 15 mer tam boy peptitlerin görüntülenmesi ve kütüphanenin çeşitliliğinin artırılması için önemlidir. T7 fajlı ekran sistemi 107 —109 T7 fajlık teknik ekran sınırına sahiptir. Bununla birlikte, 15-mer peptit kütüphanesinin çeşitliliği teorik olarak 2015 'tir (3.27 × 1019); bu nedenle, tam kütüphane yapımı için kullanılamaz. Bununla birlikte, korunmuş motiflerin benzerlik araması veya madenciliği, kütüphanedeki bu sınırlı peptit çeşitliliği ile bile proteinlerin ilaç bağlama alanlarını oluşturan amino asitlerin tespit edilmesine izin verir. Ek olarak, kütüphane peptidi içinde 3-5 amino asit uzanır (görünüm oranı T7 faj görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilebilen 1/203 ile1/ 20 5arasındadır) küçük moleküllü ilaçların tanınmasında rol oynar; bu nedenle, peptit dizilerinin hedef proteinin ilaç bağlama bölgesini oluşturan 15-mer amino asit dizileri ile% 100 eşleşmesi gerekli değildir. Gerçekten de, yaklaşık 30 benzeşim seçilmiş peptit, test edilen her ilaç için hedef proteinin bağlama bölgesini başarıyla vurgulamıştır (Şekil 4). Böylece, kullanılan ana T7 faj kütüphanesinin çeşitliliği (1.7 × 107 pfu/mL) ilaç bağlama bölgesini sezgisel olarak yeniden oluşturmak için kullanılabilir.
Tipik olarak, T7 fajlarının 3-5 kopyası, ilaç tanıyan amino asit esnemelerini barındıran 15-mer amino asit dizilerinin dizileriyle aynı dizileri gösteren, keyfi olarak izole edilen 16 plak içinde ortaya çıktı ve bu da protokolümüz kapsamındaki benzeşim seçiminin başarısını gösterdi. Bu, izole edilen 96 plakta (sayı mikro plaka formatı ile ilişkilidir) 18-30 farklı ilaç tanıyan peptit dizisinin toplandığını ve daha sonra DNA'nın dizilimi kullanılarak ve ilgili amino asit dizisinin elde edildiğini gösterir. Mevcut stratejide, T7 faj kütüphanesinin 8 μL'lik kısmının 8 mL tampon (kütüphanenin 1000 kat seyreltilmesi) içeren cuvette'e enjektesi, T7 fajlarının spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için uygundur. Benzeşim tarafından seçilen peptitlerin çeşitliliğini artırmak için, bir döngü seçimini birkaç kez tekrarlamak ve tarama başına 16 veya 32 plak izolasyonu kullanmak, aynı anda tek bir çözeltiden izolasyondan daha etkili olduğunu kanıtladı. Örneğin, yaklaşık 30 farklı sıralı benzeşim seçilmiş peptitleri etkili bir şekilde toplamak için, 3-6 set tek döngülü seçim yapıldı, her deneyde 16 veya 32 plak izole edildi. 16 veya 32 T7 faj plaklarının hepsinde aynı dizilerin ortaya çıkması, arka planın yanlışlıkla tespit edildiği veya taşıma olarak kontaminasyon olabileceği belirtilmektedir. Buna karşılık, 15 mer uzunluğundan daha kısa peptitlere sahip birçok T7 fajının aynı dizilimi veya görünümüne sahip T7 fajlarının bulunmaması, popülasyondaki T7 fajlarının özellikle yüksek olasılıkla ortaya çıktığını göstermektedir. QCM frekans azalması bu gibi durumlarda bile aynı ölçüde gerçekleştiğinden, seçimin başarısı izole T7 fajının DNA'sı sıralanarak kapsamlı bir şekilde değerlendirilmeli ve ardından peptitlerin amino asit dizilerinin biyoinformatik analizi yapılmalıdır. Ayrıca, geleneksel T7 faj ekran protokolünden farklı olarak, T7 fajlarının varyasyonu ve sayısı küçük olduğundan ve amplifikasyon ve seçim adımlarını tekrarladıktan sonra bile konsantre olmadığı için seçim turlarının tekrarlanması daha az etkilidir23.
Daha da önemlisi, bu yöntem insanların, patojenik virüslerin ve hatta bitkilerin proteomlarında küçük molekül bağlayıcı bölgelerin madenciliği için geçerlidir. İlginçtir ki, T7 faj kapsid üzerindeki peptitlerin muhtemelen yapılandırılmamış kısa ekran uzunluğu, küçük bir molekülle kenetlenme sırasında protein peptitlerinin moleküler dinamiklerini taklit edebilir; bu dinamik bağlamayı yansıtabilir24. Geleneksel yöntemlerin teknik sınırlamalarının ötesinde, küçük moleküller için aynı protokoller için geçerli olan bu strateji, ilaçlanabilir proteomu genişletebilir ve ilaç-protein etkileşim analizi ile ilgili daha ayrıntılılık sağlayabilir.
Bu yaklaşımın bazı teknik sınırlamaları göz önünde bulundurulmalıdır. Biyosensör çipinin altın elektrot yüzeyinde küçük molekül hareketsizleştirme için organik sentez gereklidir. Organik kimya uzmanı olmayanlar için, bazı hareketsizleştirme reaktifleri, küçük molekülü kaplinle mekanik olarak sabitlemek için ticari olarak mevcuttur. Ayrıca, peptitlerin bazı saçma kısımları, ilacın kenetlenmeyle ilgili olmayan proteinin bir kısmının yanlış pozitif olarak tespit edilmesine neden olabilir. Bu, T7 fajının kopyaları üretildiğinde, diğer standart amino asitlerden daha fazla kodon tarafından kodlanan lösin veya valin kalıntıları bakımından zengin beta-tabaka veya lösin bakımından zengin alanlara ampirik olarak karşılık gelir. Kitaplık peptit uzunluğunun kontrol altına alındırıcısı yanlış pozitiflerin oluşumunu kontrol edebilir. Buna karşılık, X-ışını kristalografisi veya NMR analizi kullanılarak gösterildiği gibi, kenetlenmede rol oynayan ilaç bağlama bölgesinde amino asit kalıntılarının tespit edilmediği durumlar olabilir. Bu, ilaç tanıyan peptitlerin daha fazla sayıda toplanması veya altın elektrot üzerindeki küçük moleküllerin sabitleme yönünün değiştirilmesiyle çözülebilir.
İlaç kullanımının ana ve ikincil etkileri ile ilgili birçok ilaç-protein etkileşimi henüz proteomda tanımlanamayabilir; ek olarak, ilaç emilimi, dağılımı, metabolizması, atılımı ve toksisiteden sorumlu enzimler ve taşıyıcılar da hala tanımlanamayabilir. Protein bağlama her zaman bir ilacın biyoaktivitesi için sorumlu değildir. Bu nedenle, biyolojik tahlillerden elde edilen diğer bilgilerin bir kombinasyonu, ilaçların ana ve olumsuz etkilerinden sorumlu temel ilaç hedeflerinin tanımlanmasını geliştirecektir. Bu özlü tekniğin daha fazla adaptasyonu, çok çeşitli küçük moleküllü ilaçların protein bağlayıcı alanlarının madenciliği için pratikliği ve verimi artıracaktır. Burada sunulan yöntem, sadece ilgili alanlarda temel araştırmaların yapılmasına değil, aynı zamanda klinik kullanımda ilaçların terapötik etkinliğinin veya diğer biyolojik etkilerinin altında kalan moleküler mekanizmaların açıklığa kavuşturulmasına da büyük ölçüde katkıda bulunacaktır.

İlaç bağlayıcı hedeflerin belirlenmesi, ilaçların geliştirilmesinin yanı sıra hastalıkların moleküler mekanizmalarının anlaşılması için de gereklidir. Özellikle, reseptör ve enzim proteinleri biyoaktif küçük moleküllerin en önemli moleküler hedefleridir1. Benzeşim yakalama, ilaç bağlayıcı proteinleri tanımlamak için iyi kurulmuş bir teknik olmasına rağmen2, proteinlerin düşük çözünürlüğü gibi teknik sınırlamalar, genellikle ilaç hedeflerinin doğrulanmasını engeller2. En önemlisi, hareketsiz küçük moleküller kenetlenme için gerekli özgürlük derecesini kaybeder ve daha büyük hedef proteinler üzerinde dahili olarak bulunan bağlama bölgelerine erişilemez olabilir. Ayrıca, protein yanlış katlanması, ko-kristalizasyon koşullarının analiz edilemezliği ve moleküler boyuta bağlı sınırlamalar genellikle X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans (NMR) ve ilaç-protein etkileşimlerini incelemek için diğer deneysel analizlerin kullanımını engeller.
T7 faj ekran biyopanning kullanımı, küçük molekül yemleri için proteinler üzerindeki bağlama bölgesini belirlemek için etkili bir yoldur3. Özellikle, sentetik DNA'nın çoklu klonlama bölgesine yerleştirilmesiyle oluşturulabilen T7 fajlı rastgele peptit kütüphanesi etkilidir. Proteinleri görüntüleyen T7 faj kütüphanesi ile karşılaştırıldığında, kısa peptitler fiziksel kısıtlamalar olmadan T7 faj kapsidinde görüntülenecek şekilde kolayca tasarlanmıştır, bu da katı bir destek üzerine sabitlenmiş herhangi bir küçük molekül ilacı ile sterik olarak temas edebilir2. Ayrıca, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörün T7 faj ekran biyopanning platformunagirmesi,QCM frekansındaki azalmayı izleyerek kısa peptitlerin ilaçlarla zayıf ama spesifik etkileşimlerinin tanımlanmasını sağlar4,5. Bağlı T7 fajı daha sonra konak Escherichia coli (BLT5615) enfekte edilerek doğrudan iyileşir ve uyuşturucu tanıyan kısa segmentleri barındıran benzeşim tarafından seçilen peptidi kodlayan bölgenin DNA dizisi belirlenir. Peptit popülasyonunun amino asit dizisinin daha sonraki analizi ilaç tanıma hakkında bilgi sağlar. Kurtarılan amino asit dizilerinin siliko çift yönlü hizalamasında, seçilen bir proteom içinde ilacın biyolojik hedefi hakkında bilgi edinmek için kullanılabilir. Bir ilaca yakınlığı olan protein parçalarının bu yüksek verim tanımlaması, ilaç bağlama bölgesini, çömlek parçalarından eski bir eserin yeniden inşasına benzer bir şekilde sezgisel olarak yeniden oluşturmak için kullanılabilir6. Özellikle, geleneksel proteomik yaklaşımlar başarısız olduğunda bu benzersiz yaklaşım yararlı olabilir.
Burada, T7 fajla görüntülenen peptitlerin biyopanningi için biyosensör tabanlı bir strateji ve küçük moleküllerin hedef doğrulaması için biyoinformatik analizi sunuyoruz. Geleneksel yöntemlerdeki teknik sınırlamaların ötesinde, bu strateji, aynı protokol kapsamında herhangi bir küçük ilgi molekülü için hedef proteinlerdeki ilaç bağlayıcı bölgelerin tanımlanmasını sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFFINIXQN</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCM2008-STKIT</td>
			<td>Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AADIV</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>AADIV.exe</td>
			<td>Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Sensor Chip</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMST27C</td>
			<td>4 sensor chips/package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>09-0850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAcon</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAcon.exe</td>
			<td>Identifies proteins from a population with short consensus sequences.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTAskan</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>FASTAskan.exe</td>
			<td>Lists proteins with high similarity to a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immiblization kit for AFFINIX</td>
			<td>ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)</td>
			<td>QCMIMKT</td>
			<td>SAM reagent and amine coupling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFO</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>INFO.exe</td>
			<td>Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liguid LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Autoclave for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATCH</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MATCH.exe</td>
			<td>Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5&#8211;6 amino acids in length).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF1</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF1.exe</td>
			<td>Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOTIF2</td>
			<td>Northeastern University 
			(Lee Makowski)</td>
			<td>MOTIF2.exe</td>
			<td>Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recptor ligand contacts (RELIC)</td>
			<td>Argonne National Laboratory 
			(Lemont, IL, USA)</td>
			<td>https://www.relic.anl.gov</td>
			<td>Currently unavailable 
			(Stand-alone program can be used from correspondence author upon request)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions

Reseptörler ve enzim proteinleri, biyoaktif küçük moleküller için bağlayıcı hedefler görevi gören önemli biyomoleküllerdir. Bu nedenle, ilaç-protein etkileşimlerinin hızlı ve küresel olarak doğrulanması, sadece terapötik etkinliğin altında kalan moleküler mekanizmaları anlamak için değil, aynı zamanda klinik kullanım için adsorpsiyon, dağılım, metabolizma, atılım ve toksisite (ADMET) gibi ilaç özelliklerini değerlendirmek için de son derece arzu edilir. Burada, faj kapsid üzerinde kolayca görüntülenebilen T7 faj ekranlı kısa peptitlerin biyopanlanması için biyosensör tabanlı yüksek verim stratejisi sunuyoruz. Reseptör ligand contact (RELIC) süitinde biyoinformatik programları kullanan ilaç bağlayıcı bölgelerin "kırık kalıntılar" olarak kısa segmentler içeren peptitlerin amino asit dizilerinin daha sonra analizi de gösterilmiştir. Bu yöntem klinik olarak onaylanmış iki ilaca, bir anti-tümör irinotecan'a ve bir anti-grip oseltamivirine uygulanarak, ilacı tanıyan peptit dizilerinin toplanması ve hedef proteinlerin ilaç bağlayıcı bölgelerinin vurgulanması için ayrıntılı süreç bu makalede açıklanmıştır. Burada açıklanan strateji, ilgi çekici herhangi bir küçük molekül için uygulanabilir.

Klinik olarak onaylanmış iki ilacın temsili sonuçları Şekil 3'te gösterilmiştir. İlerlemiş kolorektal kanser ve küçük hücreli dışı akciğer kanserinin tedavisinde kullanılan doğal camptothecin'in suda çözünen bir prodrugu olan Irinotecan (Şekil 3A),kanser hücrelerinde topoisomeraz I'yi inhibe eden karaciğerde SN-38'e dönüştürülür12. Ayrıca, bu bileşik doğrudan asetilkolinsteraz (AChE)13,14inhibe eder. Strateji sayesinde, Iri'yi SAM olarak hareketsiz olarak tanıyan 29 peptit, QCM biyosensör tabanlı tek döngülü biyopannlama alt kümeleri tarafından tanımlandı. 29 peptit ve AChE'nin sonraki çift yönlü hizalaması Y121, Q225, F290, E327, H440 ve Y442 için maksimum puanlar verdi ve üç boyutlu yapıdaki kısmı vurguladı. Bu amino asit kalıntıları, AChE'nin Iri bağlayıcı bölgesini oluşturanlarla tutarlıydı. Aynı peptit alt kümesi E99'u başarıyla tanımladı, L100, L252, L305, I387 ve V474 katalitik üçlü (S221, E353 ve H467) karboksisteraz (CE) civarında, bu amino asitlerin Iri15'inesterifikasyonu sırasında Iri tanıma için bir iskele oluşturduğunu gösterir. Katalitik bölgede bulunan bu tür amino asit kalıntıları, enzim reaksiyonu sorunsuz ilerledikçe ve genel deneysel koşullar altında statik kompleksi kesin olarak oluşturmadığı için geleneksel X-ışını kristalografisi veya NMR analizi kullanılarak doğrudan tanımlanamaz. Bu nedenle, belirli bir ilaç için metabolik reaksiyonlar sırasında enzimlerle oluşturulan ara komplekslerdekiler de dahil olmak üzere birden fazla proteinin ilaç bağlayıcı bölgelerinin kombinatoryal tespiti, bir ilaç için belirlenen benzeşim tarafından seçilen peptitler kullanılarak mümkündür.
Şekil 3B, influenza virüsünün neuraminidazını (NA) inhibe eden oseltamivir karboksilat için aktive edilen bir grip önleyici ilaç olan oseltamivir (Osel) için elde edilen diğer sonuçları göstermektedir16. QCM sensör çipi altın elektrot yüzeyini kaplayan Osel'i tanıyan peptitlerin 27'si, NA16'dakiOsel bağlama bölgesini başarıyla tespit etti. Bu bağlama bölgesi, Osel ile kenetlenirken dinamik hareketten geçme potansiyeli olan yapılandırılmamış peptit döngülerinden oluşur. T7 faj kapsid üzerindeki Osel tanıyan peptitler, QCM sensör çipinin altın elektrot yüzeyine sabitlenmiş Osel'e bağlanırken bu dinamik yerleştirmeyi taklit edebilir. Gripli genç hastalarda nöropsikiyatrik advers olaylar (NPAE' ler) tanımlanmıştır, bu da hastalar üzerindeki etkisi muhtemelen ilaçtan ziyade hastalığın kendisiyle ilgilidir. Çalışmalar, Osel'in kemirgenlerin merkezi sinir sisteminden (CNS) kan-beyin bariyerinde (BBB) multidrug direnci (MDR) proteini yoluyla aktif olarak ihraç edildiğini göstermiştir17. Gerçekten de, bu MDR sınıfının proteinlerinden biri, çalışmamızda diğer ışınlayıcılara, nörotransmitterle ilgili enzimlere ve reseptörlere ek olarak yüksek bir puan (DrugBank 1.0 protein veritabanında4.396'danen iyi% 5) gösterdi. Bu proteinlerin Osel'in yan etkilerinin ortaya çıkması açısından farmakolojik önemi araştırılmaktadır.
Şimdiye kadar, hedef proteinlerdeki tek ve çoklu küçük molekül bağlama bölgeleri, stratejimizi kullanan altı küçük molekül ilacı için başarıyla tanımlanmıştır (Şekil 4). Brz2001 ve roxithromycin (RXM) için, bir hedef protein üzerindeki özdeş ilaç bağlama bölgeleri, sayıları ve amino asit dizileri tamamen7,19değişen farklı peptit havuzları kullanılarak tanımlanmıştır. Ayrıca, Iri, RXM ve Osel için elde edilen tek peptit havuzları, her ilaç için AChE ve CE for Iri (Şekil 3A) 20 , anjiyomotin ve RXM19,21için CYP3A4 ve Osel için NA ve MDR ilişkili protein gibi farklı proteinler üzerinde birden fazla bağlayıcı bölgenin tanımlanmasına yol açmıştır. Anti-tümör bileşik doxorubicin (FANCF)22ve anti-anjiyojenik makrolid antibiyotik RXM (anjiyomotin)19için bilinmeyen bir moleküler hedef tanımlanmıştır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig1v2.jpg"> Şekil 1: T7 fajla görüntülenen peptit kütüphanesinin QCM biyosensör bazlı biyopanninginin şematik gösterimi. Rastgele peptitleri görüntüleyen bir T7 faj kütüphanesi, QCM biyosensör çipinin batırıldığı ve frekansın stabilize edildiği tamponu (karıştırma altında) içeren cuvette enjekte edilir. T7 fajlarının sensör çipinin altın elektrot yüzeyinde hareketsiz hale getirilen küçük moleküllere bağlanması nedeniyle frekans azaltmayı izledikten sonra sensör çipi osilatörden ayrılır. Bağlı T7 fajından DNA daha sonra konak E. coli (BLT5615) enfeksiyonundan sonra doğrudan iyileşir. Elde edilen T7 fajları plak oluşumu ile izole edilir ve son olarak T7 faj kapsidinde görüntülenen ilaç benzeşimi seçilen peptitin amino asit dizisi genel faj görüntüleme yöntemine göre belirlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig2v2.jpg"> Şekil 2: İlaçla seçilmiş peptitler ile tek veya çoklu proteinler arasındaki dizi karşılaştırmasının nicel değerlendirmesinin şematik gösterimi. İlaçla seçilen peptit dizileri sırasıyla tek ve çoklu proteinlerin birincil amino asit dizileri ile hizalanır ve her 3-5 amino asit kümesindeki benzerlik, değiştirilmiş bir BLOSUM62 matrisine göre çift yönlü hizalama ile kümülatif olarak puanlanır. Ortaya çıkan arsa veya diyagram, protein üzerinde potansiyel bir ilaç bağlama bölgesi oluşturan kalıntıları veya bölümleri gösterir. Uygun bir RELIC programı kullanarak daha fazla analiz, üç boyutlu yapıdaki bağlama sitesini vurgular (PDB dosyası varsa) veya muhtemelen bağlama hedefi olan tüm proteinleri sıralar (HETEROalign programı şu anda kullanılamıyor). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig3v2.jpg"> Şekil 3:Peptit toplama ve sonraki biyoinformatik analizinin temsili sonuçları. (A) Irinotecan (anti-tümör prodrug, topoisomeraz I inhibitörü). T7 faj etkileşimi QCM frekansında azalma olarak 10 dakika izlendi. Bağlı T7 fajının DNA'sı ele geçirildi ve karşılık gelen amino asit dizisini belirlemek için sıralandı. Tek döngülü biyopannlamanın bir alt kümesi kullanılarak toplanan 29 adet 15 mer peptidden oluşan amino asit dizileri, AChE'nin Iri bağlayıcı bölgesini oluşturan amino asitleri vurgulamıştır [PDB ID 1U65]. Aynı 29 peptit kullanılarak yapılan daha fazla değerlendirmede, Iri'yi SN-38'e (aktif form) dönüştüren bir karaciğer enzimi olan CE'deki katalitik triyad'ın komşu amino asit kalıntıları (de-esterifikasyon için iskele kalıntıları) vurgulandı [PDB ID: 1K4Y]. Taranmamış üst kütüphane7,19'dan rastgele seçilen103 peptitin benzerlik puanları, kütüphane önyargısını ortadan kaldırmak için bu puanlardan çıkarıldı. Bu rakamlar Elsevier'in izniyle Ref. 20'den çoğaltılır. (B) Oseltamivir (grip önleyici ilaç). Osel tanıyıcı amino asitler içeren 27 peptit, neuraminidaz (NA) (virüs enzimi) için Osel bağlayıcı bölgenin düzensiz kısımlarını vurguladı [PDB Kimliği: 2HT7]. DrugBank 1.018'deki 27 peptit ve 4.396 protein arasındaki dizi benzerliğinin küresel olarak doğrulanması, NA'nın merkezi sinir sisteminin işlevleriyle ilişkili konak insan proteinlerine ek olarak ilk% 5 aralığında olduğunu ortaya koydu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig4v2.jpg"> Şekil 4:Bağlama hedefleri bustrateji kullanılarak tanımlanan küçük moleküllerin özeti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions at JoVE.com

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Bu çalışma, ilaç-peptit etkileşimlerini tanımlamak için bir strateji sunmayı amaçlamaktadır. Strateji, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörüne dayanan ilaç tanıyan kısa peptitlerin biyopannasyonunu ve ardından ilaç tanıma ve ilaç bağlayıcı bölgelerin proteinler üzerinde ek açıklama için elde edilen bilgileri nicel olarak değerlendirmek için biyoinformatik analizini içerir.

İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

biosensor-based-high-throughput-biopanning-bioinformatics-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.9K Görüntüleme.  National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology. Bu çalışma, ilaç-peptit etkileşimlerini tanımlamak için bir strateji sunmayı amaçlamaktadır. Strateji, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörüne dayanan ilaç tanıyan kısa peptitlerin biyopannasyonunu ve ardından ilaç tanıma ve ilaç bağlayıcı bölgelerin proteinler üzerinde ek açıklama için elde edilen bilgileri nicel olarak değerlendirmek için biyoinformatik analizini içerir.

Video: Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

FlexStation kullanarak 3 TRP Kanal İşlevleri Yüksek Verimli Tarama Orta Hücre tabanlı Kalsiyum Testi

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Biyomühendislik

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Plasenta karşısında Ksenobiyotik ve Nanomalzemelerin Ulaştırma Hızı belirlenmesi kullanarak<em&gt; Ex vivo</em&gt; İnsan Plasental Perfüzyon Modeli

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

Brillouin Saçılma Analiz Yüksek Hızlı Alt GHz Spektrometre

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...