אנו מודים לד"ר ג'וליו די מינין על הפקת קווי phaESC וד"ר רמו פריימן על ניתוח ציטומטריית זרימה. אנו גם מכירים בגברת מיכל שפנר ומר תומאס מ. הנאק על תמיכה טכנית בהעברת עוברים. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע של שווייץ (מענק 31003A_152814/1).

<ol>
	<li>Ellegren, H., Galtier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genetic+diversity.">Determinants of genetic diversity.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (7), 422-433 (2016).</li><li>Huijbers, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice:+A+decision+guide.">Generating genetically modified mice: A decision guide.</a> Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).</li><li>Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+of+semi-cloned+embryos+generated+from+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> PloS One. 15 (9), 0233072 (2020).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+live+transgenic+mice.">Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.</a> Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+fertile+bimaternal+offspring+following+intracytoplasmic+injection+of+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).</li><li>Wan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+fertile+mice.">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice.</a> Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genetically+modified+mice+by+oocyte+injection+of+androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell. 149 (3), 605-617 (2012).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+efficiently+support+mouse+generation+by+oocyte+injection.">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection.</a> Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+genetics+through+derivation+of+haploid+mouse+embryonic+stem+cells.">Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).</li><li>Leeb, M., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+haploid+embryonic+stem+cells+from+mouse+embryos.">Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos.</a> Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).</li><li>Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+reconstituted+mouse+eggs+suggests+imprinting+of+the+genome+during+gametogenesis.">Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis.</a> Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).</li><li>Li, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bimaternal+and+bipaternal+mice+from+hypomethylated+haploid+ESCs+with+imprinting+region+deletions.">Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+maintenance+of+mouse+haploid+embryonic+stem+cells.">Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Shuai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mammalian+offspring+by+haploid+embryonic+stem+cells+microinjection.">Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+chromosome+constitution+of+strontium-induced+mouse+parthenogenones.">Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones.</a> Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).</li><li>Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheep+cloned+by+nuclear+transfer+from+a+cultured+cell+line.">Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line.</a> Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).</li><li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei.">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).</li><li>Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+offspring+derived+from+fetal+and+adult+mammalian+cells.">Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.</a> Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).</li><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+frogs+derived+from+the+nuclei+of+single+somatic+cells.">Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells.</a> Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).</li><li>Campbell, K. H., Alberio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+the+genome:+role+of+the+cell+cycle.">Reprogramming the genome: role of the cell cycle.</a> Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+genetic+screening+in+mice+with+haploid+embryonic+stem+cells+carrying+a+guide+RNA+library.">CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).</li><li>Bai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genetic+screening+in+mice+through+haploid+embryonic+stem+cells+identifies+critical+genes+in+bone+development.">Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development.</a> PLoS Biology. 17 (7), 3000350 (2019).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+base-editing+screening+in+mice+identifies+DND1+amino+acids+that+are+critical+for+primordial+germ+cell+development.">CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development.</a> Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שיבוט של יונקים על ידי העברה גרעינית תא סומטי (SCNT) כבר חלוץ בשנות ה-90 19,20,21. התפתחויות אלה בעקבות מחקרי שיבוט שנערכו 30 שנה קודם לכן דו-חיים22. העיכוב הניכר משקף את הקושי באמברולוגיה ובהטבעה גנומית ביונקים. הפיתוח של SCNT יונקים הוא הבסיס ליישום של haESC להחלפת זרע, אשר מפורט בפרוטוקול זה.
סינכרון מחזור התא הוא גורם חשוב להצלחת SCNT23. זה גם המקרה להזרקה של haESC בפרוטוקול זה. החדרת גנום תורם לנמען דורשת להתאים את שלבי מחזור התא כדי למנוע שבירה כרומוזומלית או aneuploidies שיבטל את התפתחות העובר. שיבוט למחצה יש את המורכבות הנוספת כי שני גנומים ציטופלסט צריך להיות תואם. דו"ח קודם הוכיח כי הזרקה של M-שלב נעצר אנדרוגנטיקה haESCs הניב שיעור התפתחותי טוב יותר של עוברים משובטים למחצה מאשר הזרקה של G1-שלב haESCs לתוך ביציות7. דוח זה מציע M-phase כנקודת סינכרון מתאימה לשכפול למחצה. בהתאם לכך, phaESCs נעצרו במיטוזה עם demecolcine והוזרק לתוך ooplasm של ביציות MII, אשר נעצרו באופן טבעי מטפאאז השני של מיוזיס. חשוב לציין, מעצר שלב M יכול להיות מושגת ב- ESCs העכבר ביעילות גבוהה, מתן סנכרון מעולה בין מחזורי תא התורם הנמען.
במהלך המיטוזיס, הקרום הגרעיני מתפרק וצורות ציר שאליהן מתחברים הכרומוזומים המשוכפלים. לאחר הזרקת DKO-phaESCs שלב M, כרומטידים אחות מופרדים לתוך גוף קוטב מדומה ואת zygote7 (איור 3E). כתוצאה מכך, קבוצה אחת של כרומוזומים מ- DKO-phaESC תורמת לעובר המשובט למחצה. זה קריטי כי כרומטידים אחות של כרומוזומי DKO-phaESC ניתן להפריד כראוי לאחר הזרקה. קרום הפלזמה של DKO-phaESC שלם מונע הפרדה לגוף קוטב מדומה. אכן ראינו מקרים נדירים שבהם קרום הפלזמה של DKO-phaESCs לא נקרע, ועוברים הציגו DKO-phaESCs שלמים באופלזמה לאחר ההזרקה(איור 3D). לכן, יש להקפיד להסיר את קרום הפלזמה של DKO-phaESCs על ידי pipetting. במהלך ההזרקה, חשוב באותה מידה כדי למנוע את ההפרעה של ציר meiotic של ביצית, אשר יכול להוביל פגמים בהפרדה כרומוזום לגרום aneuploidy גם כן.
ביונקים, הטבעה גנומית מגבילה את היישום של phaESCs כתחליף זרע. haESCs הפרתנוגנטיים יש תצורה אימהית של הטבעות גנומיות, ואילו הזרע יש תצורה אבהית. לכן, הדור של גורים לטווח מלא לא התרחשה לאחר הזרקת phaESCs סוג פראי כתחליף זרע. כדי להתגבר על מגבלה זו, מחיקות של IG- ו- H19-DMRs מתוכננות ב- phaESCs. שינוי של ביטוי מוטבע ב Igf2-H19 האימהי ו Gtl2-Dlk1 loci מספיק כדי לשנות את התצורה של הטבעות גנומיות המאפשר הדור של עכברים משובטים למחצה בתדירות של מעל 5.1%, בהתבסס על עוברים 2 תאים שהועברו. תצפיות אלה מצביעות על כך שהתמקדות בשני גנים מוטבעים מעבירה את הגנום של phaESCs לתצורה אבהית תפקודית שיכולה להחליף זרע בעכברים. עם זאת, נדרש שינוי גנטי קבוע של ה- phaESCs עבור אסטרטגיה זו. כאסטרטגיה חלופית, ניתן לשקול haESC אנדרוגנטי. ה-HAESCs האנדרוגנטיים נגזרים מגנום הזרע ובעלי הטבעות אבהיות. היו דיווחים כי haESCs אנדרוגנטיים wildtype תרמו כתחליף זרע כדי ליצור גורים לטווח מלא בתדירות בין 1.3% ו 1.9% של עוברים שהועברו4,7,24. גורים לטווח מלא התקבלו גם על ידי הזרקת haESCs אנדרוגנטיים עם מחיקות של IG- ו H19-DMRs בתדירות של 20.2% של עוברים 2 תאים שהועברו24. היעילות המוגברת של שיבוט למחצה באמצעות haESCs אנדרוגנטית שונה סביר כי הטבעות יכול להיות לא יציב בתרבות. פגמים בהטבעה מתוקנים על ידי מחיקות גנטיות של DMRs קריטיים.
בהתחשב בקושי בהחדרת שינויים גנטיים ישירות לתוך גנום ביצית או זרע, haESCs הם כלי רב ערך למניפולציה הגנום ההורי בנפרד. שימוש ב- haESCs כתחליף לזרע מספק יתרון יוצא דופן לעריכת גנום בחיידק העכבר. מחקר שנערך לאחרונה שילב עריכת גנום מבוסס CRISPR /Cas9 עם היישום של haESCs לאפיון אזורי הטבעה שהם קריטיים להתפתחות עוברית12. מחקר זה ניתח את התפקיד של Rasgrf1-DMR בשילוב עם H19-ו- IG-DMRs בפיתוח של עכברים דו-מטרניים, ואת הפונקציה של 7 DMRs שונים בהתפתחות של עכברים דו-קוטביים. השיטה להחלפת haESCs לזרע היוותה את הבסיס לגישות סינון גנטי לזיהוי חומצות אמינו מרכזיות בתוך חלבון DND1 בהתפתחות תאי נבט ראשוניים ולזיהוי גנים בהתפתחותהעצם 24,25,26. מחקרים על הטבעה גנומית והקרנה גנטית כדי לזהות גורמי מפתח בהתפתחות העוברית הם גישות ניכרות ליישום של haESCs כמו גנומים גמטיים.

ביונקים, גמטות הן התאים היחידים שמעבירים מידע גנטי לדור הבא. היתוך של ביצית וזרעון יוצר זיגוטה דיפלואידית המתפתחת לחיה בוגרת. מוטציות בגנומים גמטיים עוברות בירושה לצאצאים ונוהגות וריאציה גנטית במינים1. מבוא של מוטציות הנבט הוחל לייצר בעלי חיים מהונדסים גנטית למחקרים ביולוגיים מגוונים כולל אפיון של תפקוד גנים ומידול מחלות. הן ביציות והן זרעונים הם תאים מובחנים סופניים ומתמחים מאוד שהפסיקו את התפשטותם. לכן, שינוי ישיר של gametes הוא קשה מבחינה טכנית, וגישות מיוחדות פותחו. שינויים גנטיים ניתן להכניס לתוך נבט העכבר על ידי הזרקת ESCs מהונדסים גנטית לתוך blastocysts, שם הם משתלבים העובר המתפתח ליישב את הנבט. בנוסף, שינוי גנטי של זיגוטים באמצעות גישות עריכת גנום, כולל מערכת CRISPR / Cas9,הפך מאומץנרחב 2 .
לאחרונה דווח על גישה יוצאת דופן, המיישמת haESCs כתחליף לגנום גמטי3,4,5,6,7,8. HaESCs הם קווי תאי גזע הנגזרים ממסת התא הפנימית של בלסטוציסטים הפלואידיים פרתנוגנטיים או אנדרוגנטיים ובעלי קבוצה אחת של כרומוזומים4,7,9,10. הוכח כי הן haESCs parthenogenetic ו אנדרוגנטית יכול לתרום הגנום של עכברים משובטים למחצה לאחר הזרקה intracytoplasmic לתוך ביציות. בניגוד לגישות אחרות, הגנומים של haESCs ניתן לשנות ישירות בתרבות בשל יכולת ההתחדשות העצמית שלהם. החדרת שינויים גנטיים לתוך הנבט על ידי החלפת זרע עם haESCs היא שיטה חשובה למחקרים ביולוגיים. הוא מספק אפשרות בנפרד תרבות ולתפעל את הגנום האימהי או האבהי, אשר נגזרים haESCs parthenogenetic או אנדרוגנטית, בהתאמה. לאחר מכן ניתן להשתמש ב- HaESCs כתחליף גנום גמטי, אשר יתרון במיוחד עבור מחקרים של הטבעה גנומית, ביטוי ספציפי לאל ותהליכים ספציפיים להורים.
בעכברים, מידע גנומי אימהי וגברי נדרש להתפתחות עוברית תקינה11. לכן, גורים לטווח מלא לא ניתן היה להשיג כאשר haESCs פרתנוגנטיים מסוג בר (phaESCs) הוזרקו להחליף את הגנום הזרע5,8. כדי להתגבר על הבלוק ההתפתחותי, יש לתקן את ההטבעה הגנומית הגנומית האימהית של ה- haESCs הפרתנוגנטיים לתצורה אבהית. זה יכול להיות מושגת על ידי מניפולציה של אזורים מתילציה דיפרנציאלית (DMRs). עד כה, מחיקות ממוקדות של H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR, ו Rasgrf1-DMR נחקרו כדי להדחיק גנים מבוטאים אימהית ב phaESCs3,5,8,12. מחקרים אלה הראו כי מחיקות של H19-DMR ו- IG-DMR מספיקות כדי להמיר אימהי לתצורת חותם אבהי שיכולה להחליף כרומוזומי זרע. הזרקה תוך-טופלסמית של phaESCs הנושאים את שתי מחיקות DMR לתוך ביציות הניבו גורים משובטים למחצה בתדירות שבין 5.1% ל -15.5% מהעוברים הדו-תאיים שהועברו.
פרוטוקול זה מבוסס על היישום של phaESCs עם מחיקות של H19-DMR ו- IG-DMR, אשר אנו במונח כפול נוקאאוט phaESCs (DKO-phaESCs). אנו מספקים הוראות מפורטות לשינוי ההטבעה הגנומית ב- phaESCs כדי להקים קווי DKO-phaESC, להזרקת DKO-phaESCs לביוציטים כתחליף לגנום זרע, לתרבות של עוברים משובטים למחצה לבסטוציסטים, ולקבלת עכברים משובטים למחצה. פרוטוקול זה הוא התייחסות לחוקרים הזקוקים למניפולציה מדויקת וישירה של הגנום האבהי ודור של עוברים ועכברים משובטים למחצה.

<table><tbody><tr><td>1.5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>15 ml Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>BSA fraction</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Demecolcine solution</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DR4 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Freezing medium</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Hepes solution</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Irradiated MEF</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td><td>(Homemade)</td><td>-</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Lipofection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac transposase plasmid</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX330 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX458 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>5 mL Tube</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>5 mL Tube with cell strainer cap</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>30-gauge 1/2 inch needle</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>B6D2F1 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD animal health</td><td>49451</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 IU</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>10-cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>6 cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Center-well dish</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Digital rocker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M16 medium</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Strontium chloride</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Borosilicate glass cappilary</td><td>Science product</td><td>GB100T-8P</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>CellTram 4r Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Holding pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microinjection pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microlaoder tips</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micromanipulaor arms</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>Microinjection</td></tr></tbody></table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

באורגניזמים עם רבייה מינית, תאי נבט הם המקור לתאים totipotent המתפתחים לאנשים חדשים. בעכברים, הפריה של ביצית על ידי זרעון יוצר זיגוטה totipotent. לאחרונה, מספר פרסומים דיווחו כי תאי גזע עובריים haploid (haESCs) יכול להיות תחליף גנומים גמטיים ולתרום עוברים, אשר מתפתחים לעכברים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליישם haESCs parthenogenetic כתחליף של זרע כדי לבנות עוברים על ידי הזרקה intracytoplasmic לתוך ביציות. פרוטוקול זה מורכב שלבים להכנת haESCs כתחליף זרע, להזרקת כרומוזומי haESC לתוך ביציות, ולתרבות של עוברים משובטים למחצה. העוברים יכולים להניב עכברים פוריים משובטים למחצה לאחר העברת העובר. שימוש ב- haESCs כתחליף זרע מקל על עריכת הגנום בחיידק, מחקרים על התפתחות עוברית וחקירת הטבעה גנומית.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm at JoVE.com

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

מאמר זה נועד להדגים את השימוש בתאי גזע עובריים הפלואידיים פרתנוגנטיים כתחליף לזרע לבניית עוברים משובטים למחצה.

יישום של עכבר פרתנוגנטי תאי גזע עובריים הפלואיד כתחליף של זרע

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

application-mouse-parthenogenetic-haploid-embryonic-stem-cells-as

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.5K Views.  ETH Zurich. מאמר זה נועד להדגים את השימוש בתאי גזע עובריים הפלואידיים פרתנוגנטיים כתחליף לזרע לבניית עוברים משובטים למחצה.

Video: Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Genetics

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the efficiency in developing gene-knockout mice by inducing small indel mutation would be sufficient enough, the efficiency of embryo genome editing for making large-size DNA knock-in (KI) is still low. Therefore, in contrast to the direct KI method in embryos, gene targeting using embryonic stem cells (ESCs) followed by embryo injection to develop chimera mice still has several advantages (e.g., high throughput targeting in vitro, multi-allele manipulation, and Cre and flox gene manipulation can be carried out in a short period). In addition, strains with difficult-to-handle embryos in vitro, such as BALB/c, can also be used for ESC targeting. This protocol describes the optimized method for large-size DNA (several kb) KI in ESCs by applying CRISPR/Cas9-mediated genome editing followed by chimera mice production to develop gene-manipulated mouse models.

Here we present a protocol for developing genetically modified mouse models using embryonic stem cells, especially for large DNA knock-in (KI). This protocol is tuned up using CRISPR/Cas9 genome editing, resulting in significantly improved KI efficiency compared with the conventional homologous recombination-mediated linearized DNA targeting method.

מיקוד גנים יעיל ביותר בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the ...

<meta charset="utf8"></head><body>הליך הזרקת זרע עגול Murine לחקר התפתחות עוברית

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>הזרקת זרע עגולה לעכבר

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

הזרקת זרע עגולה לעכבר

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

<meta charset="utf8"></head><body>מודל עכבר ICSI-ET לחקר השפעות ארוכות טווח על חילוף החומרים של גלוקוז

Monitoring Blood Glucose in Mouse Offspring After Intracytoplasmic Sperm Injection

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life roughly equivalent to 40 human years. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is a commonly used assisted reproductive technology in clinical practice. However, given its relatively recent emergence about 30 years ago, the long-term effects of this technique on human development remain unclear. In this study, we established the ICSI combined with embryo transfer (ET) method using a mouse model. The results demonstrated that normal mouse sperm, after undergoing in vitro culture and subsequent ICSI, exhibited a fertilization rate of 89.57% and a two-cell rate of 87.38%. Following ET, the birth rate of offspring was approximately 42.50%. Furthermore, as the mice aged, fluctuations in glucose metabolism levels were observed, which may be associated with the application of the ICSI technique. These findings signify that the mouse ICSI-ET technique provides a valuable platform for evaluating the impact of sperm abnormalities on embryo development and their long-term effects on offspring health, particularly concerning glucose metabolism. This study provides important insights for further research on the potential effects of the ICSI technique on human development, emphasizing the necessity for in-depth investigation into the long-term implications of this technology.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: חקר ההשפעות הבריאותיות ארוכות הטווח של הזרקת זרע תוך ציטופלזמית על צאצאים

Here, we present a protocol to establish an intracytoplasmic sperm injection (ICSI)-embryo transfer (ET) mouse model, allowing us to observe age-related changes in glucose metabolism that may be attributed to ICSI, providing insights into its potential long-term impacts on human development.

ניטור רמת הסוכר בדם בצאצאי עכבר לאחר הזרקת זרע תוך ציטופלזמית

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life ...

בידוד וגנוטיפ של עובר עכבר גסטרולציה לריצוף תא בודד

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Author Spotlight: צינור לניתוח עוברים מוטנטיים ספציפיים לשושלת ברזולוציה של תא בודד

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

יישום של עכבר פרתנוגנטי תאי גזע עובריים הפלואיד כתחליף של זרע

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

מיקוד גנים יעיל ביותר בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית

הזרקת זרע עגולה לעכבר

הזרקת זרע עגולה לעכבר

הזרקת זרע עגולה לעכבר

ניטור רמת הסוכר בדם בצאצאי עכבר לאחר הזרקת זרע תוך ציטופלזמית

ניטור רמת הסוכר בדם בצאצאי עכבר לאחר הזרקת זרע תוך ציטופלזמית

ניטור רמת הסוכר בדם בצאצאי עכבר לאחר הזרקת זרע תוך ציטופלזמית

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה