نشكر الدكتور جوليو دي مينين على اشتقاق خطوط الكتائب والدكتور ريمو فريمان على عملية قياس التدفق الخلوي. ونعترف أيضا بالسيدة ميشيل شافنر والسيد توماس م. هينيك للدعم التقني في نقل الأجنة. ودعمت هذا العمل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (المنحة 31003A_152814/1).

<ol>
	<li>Ellegren, H., Galtier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genetic+diversity.">Determinants of genetic diversity.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (7), 422-433 (2016).</li><li>Huijbers, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice:+A+decision+guide.">Generating genetically modified mice: A decision guide.</a> Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).</li><li>Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+of+semi-cloned+embryos+generated+from+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> PloS One. 15 (9), 0233072 (2020).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+live+transgenic+mice.">Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.</a> Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+fertile+bimaternal+offspring+following+intracytoplasmic+injection+of+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).</li><li>Wan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+fertile+mice.">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice.</a> Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genetically+modified+mice+by+oocyte+injection+of+androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell. 149 (3), 605-617 (2012).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+efficiently+support+mouse+generation+by+oocyte+injection.">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection.</a> Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+genetics+through+derivation+of+haploid+mouse+embryonic+stem+cells.">Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).</li><li>Leeb, M., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+haploid+embryonic+stem+cells+from+mouse+embryos.">Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos.</a> Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).</li><li>Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+reconstituted+mouse+eggs+suggests+imprinting+of+the+genome+during+gametogenesis.">Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis.</a> Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).</li><li>Li, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bimaternal+and+bipaternal+mice+from+hypomethylated+haploid+ESCs+with+imprinting+region+deletions.">Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+maintenance+of+mouse+haploid+embryonic+stem+cells.">Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Shuai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mammalian+offspring+by+haploid+embryonic+stem+cells+microinjection.">Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+chromosome+constitution+of+strontium-induced+mouse+parthenogenones.">Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones.</a> Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).</li><li>Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheep+cloned+by+nuclear+transfer+from+a+cultured+cell+line.">Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line.</a> Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).</li><li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei.">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).</li><li>Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+offspring+derived+from+fetal+and+adult+mammalian+cells.">Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.</a> Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).</li><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+frogs+derived+from+the+nuclei+of+single+somatic+cells.">Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells.</a> Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).</li><li>Campbell, K. H., Alberio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+the+genome:+role+of+the+cell+cycle.">Reprogramming the genome: role of the cell cycle.</a> Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+genetic+screening+in+mice+with+haploid+embryonic+stem+cells+carrying+a+guide+RNA+library.">CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).</li><li>Bai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genetic+screening+in+mice+through+haploid+embryonic+stem+cells+identifies+critical+genes+in+bone+development.">Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development.</a> PLoS Biology. 17 (7), 3000350 (2019).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+base-editing+screening+in+mice+identifies+DND1+amino+acids+that+are+critical+for+primordial+germ+cell+development.">CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development.</a> Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

استنساخ الثدييات عن طريق نقل الخلايا الجسدية النووية (SCNT) كانت رائدة في 1990s19،20،21. وجاءت هذه التطورات في أعقاب دراسات الاستنساخ التي أجريت قبل 30 عاما فيالبرمائيات 22. ويعكس التأخير الكبير صعوبة علم الأجنة وبصمات الجينوم في الثدييات. تطوير الثدييات SCNT هو الأساس لتطبيق haESC لاستبدال الحيوانات المنوية ، وهو مفصل في هذا البروتوكول.
مزامنة دورة الخلية هو عامل مهم لنجاح SCNT23. وهذا هو الحال أيضا لحقن haESC في هذا البروتوكول. يتطلب إدخال جينوم المتبرع إلى المتلقي مطابقة مراحل دورة الخلية لتجنب الكسر الكروموسومي أو الأنوبلويدات التي من شأنها إلغاء نمو الجنين. شبه الاستنساخ لديه تعقيد إضافي أن اثنين من الجينوم وstoplast تحتاج إلى أن تكون متوافقة. وقد أثبت تقرير سابق أن حقن ال haESCs الاندروجينية المعتقلين في مرحلة M أسفر عن معدلات نمو أفضل للأجنة شبه المستنسخة من حقن haESCs من مرحلة G1 في البويضات7. ويقترح هذا التقرير المرحلة M كنقطة تزامن مناسبة للاستنساخ شبه. وبناء على ذلك، ألقي القبض على الكتائب ميتوتيتشيلي في مرحلة ميتافيزي مع demecolcine وحقنها في ooplasm من البويضات MII، والتي تم القبض عليها بشكل طبيعي في ميتافاز الثاني من الميوسيس. والأهم من ذلك، يمكن تحقيق الاعتقال في المرحلة M في ESCs الماوس بكفاءة عالية، وتوفير تزامن ممتاز بين دورات الخلية المانحة والمتلقية.
أثناء الانقسام ، ينهار الغشاء النووي وأشكال المغزل التي ترتبط بها الكروموسومات المكررة. بعد حقن M-المرحلة DKO-phaESCs، يتم فصل الكروماتيدات الشقيقة إلى جسم قطبي زائف وzygote7 (الشكل 3E). وبالتالي، تساهم مجموعة واحدة من الكروموسومات من DKO-phaESC في الجنين شبه المستنسخ. ومن الأهمية بمكان أن الكروماتيدات الشقيقة للكروموسومات DKO-phaESC يمكن فصلها بشكل صحيح بعد الحقن. غشاء البلازما من DKO-phaESC سليمة يمنع الفصل في الجسم القطبي الزائف. لقد لاحظنا بالفعل حالات نادرة لم يتم فيها تمزق غشاء البلازما في DKO-phaESCs ، وأظهرت الأجنة DKO-phaESCs سليمة في ooplasm بعد الحقن(الشكل 3D). لذلك ، يجب توخي الحذر لإزالة غشاء البلازما من DKO-phaESCs عن طريق الأنابيب. أثناء الحقن ، من المهم بنفس القدر تجنب تعطيل المغزل الميوتيكي للبويضة ، مما قد يؤدي إلى عيوب فصل الكروموسومات والحث على الانسداد أيضا.
في الثدييات ، يحد البصمة الجينومية من تطبيق الكتائب كبديل للحيوانات المنوية. تمتلك haESCs البارثينوجينية تكوينا أموميا من البصمات الجينومية ، في حين تمتلك الحيوانات المنوية تكوينا أبويا. لذلك ، لم يحدث جيل من الجراء على المدى الكامل بعد حقن الكتائب البرية كبديل للحيوانات المنوية. للتغلب على هذا القيد، يتم تصميم عمليات حذف IG- و H19-DMRs في phaESCs. تعديل التعبير المطبوع في Igf2-H19 الأم وGl2-Dlk1 loci كافية لتغيير تكوين بصمات الجينوم للسماح لتوليد الفئران شبه المستنسخة مع وتيرة أكثر من 5.1٪، على أساس الأجنة المنقولة 2 خلية. تشير هذه الملاحظات إلى أن استهداف جينين مطبوعين يحول جينوم الكتائب إلى تكوين أبوي وظيفي يمكن أن يحل محل الحيوانات المنوية في الفئران. ومع ذلك، يلزم إدخال تعديل وراثي دائم على الكتائب من أجل هذه الاستراتيجية. كاستراتيجية بديلة، يمكن النظر في haESC الاندروجينية. وتستمد haESCs الاندروجينية من جينوم الحيوانات المنوية وتمتلك بصمات الأب. كانت هناك تقارير تفيد بأن haESCs الذكورية البرية ساهمت كبديل للحيوانات المنوية لتوليد الجراء على المدى الكامل على تردد يتراوح بين 1.3٪ و 1.9٪ من الأجنة المنقولة4و7و24. كما تم الحصول على الجراء كاملة المدة عن طريق حقن haESCs الاندروجينية مع حذف IG- وH19-DMRs على تردد 20.2٪ من الأجنة المنقولة من 2 خلايا24. ومن المرجح أن تكون زيادة كفاءة شبه الاستنساخ باستخدام مركبات هايسك الاندروجينية المعدلة بسبب عدم استقرار البصمات في الثقافة. يتم تصحيح عيوب الطباعة عن طريق الحذف الوراثي ل DMRs الحرجة.
وبالنظر إلى صعوبة إدخال تعديلات جينية مباشرة على جينوم البويضات أو الحيوانات المنوية، فإن ال haESCs هي أداة قيمة للتلاعب بالجينوم الأبوي بشكل منفصل. استخدام haESCs كبديل للحيوانات المنوية يوفر ميزة ملحوظة لتحرير الجينوم في الجرثومة الماوس. وقد جمعت دراسة حديثة بين تحرير الجينوم القائم على CRISPR/Cas9 وتطبيق haESCs لتوصيف المناطق المطبوعة التي تعتبر حاسمة للتنمية الجنينية12. حللت هذه الدراسة دور Rasgrf1- DMR بالاشتراك مع H19- و IG- DMRs في تطوير الفئران ثنائية اللون ، ووظيفة 7 DMRs مختلفة في تطوير الفئران ثنائية الترنيخ. شكلت طريقة استبدال haESCs للحيوانات المنوية الأساس لنهج الفحص الجيني لتحديد الأحماض الأمينية الرئيسية داخل بروتين DND1 في تطوير الخلايا الجرثومية البدائية وتحديد الجينات في نمو العظام24و25و26. الدراسات على البصمة الجينومية والفحص الجيني لتحديد العوامل الرئيسية في النمو الجنيني هي نهج كبيرة لتطبيق haESCs كجينوم لعبة.

في الثدييات، الأمشاج هي الخلايا الوحيدة التي تنقل المعلومات الوراثية إلى الجيل القادم. الانصهار من البويضات والحيوانات المنوية يشكل الزيغوت diploid التي تتطور إلى بالغ. الطفرات في الجينوم gametic وبالتالي ورثت من قبل النسل ودفع الاختلاف الجيني في الأنواع1. وقد تم تطبيق إدخال الطفرات في الجرثومة لإنتاج الحيوانات المعدلة وراثيا لدراسات بيولوجية متنوعة بما في ذلك توصيف وظيفة الجينات ونمذجة الأمراض. كل من البويضات والحيوانات المنوية هي خلايا متمايزة بشكل ميؤوس منه ومتخصصة للغاية توقفت عن الانتشار. ولذلك ، فإن التعديل المباشر ل gametes صعب من الناحية الفنية ، وتم تطوير نهج متخصصة. ويمكن إدخال تعديلات جينية في الجرثومة الماوس عن طريق حقن ESCs المعدلة وراثيا في الكيسات الأريمية، حيث أنها تندمج في الجنين النامية واستعمار الجرثومة. بالإضافة إلى ذلك ، أصبح التعديل الوراثي للzygotes باستخدام نهج تحرير الجينوم ، بما في ذلك نظام CRISPR / Cas9 ، معتمدا على نطاق واسع2.
في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن نهج متميز ، والذي يطبق haESCs كبديل لجينوم gametic3،4،5،6،7،8. HaESCs هي خطوط الخلايا الجذعية المستمدة من كتلة الخلية الداخلية من الكيسات الأريمية الهابلويدية البارثينوجينية أو الاندروجينية وتمتلك مجموعة واحدة من الكروموسومات4و7و9و10. وقد ثبت أن كلا من haESCs البارثينوجينية والدروجينية يمكن أن تسهم في جينوم الفئران شبه المستنسخة بعد الحقن داخل السيتوبلازمي في البويضات. وعلى النقيض من النهج الأخرى، يمكن تعديل جينوم الهايسك مباشرة في الثقافة بسبب قدرتها على التجديد الذاتي. إدخال التعديلات الوراثية في الجرثومة عن طريق استبدال الحيوانات المنوية مع haESCs هو وسيلة هامة للدراسات البيولوجية. وهو ينص على إمكانية زراعة الجينوم الأمومي أو الأبوي والتعامل معه بشكل منفصل، وهو مستمد من ال haESCs البارثينوجينية أو الاندروجينية، على التوالي. ويمكن بعد ذلك استخدام HaESCs كبديل الجينوم gametic ، وهو أمر مفيد بشكل خاص لدراسات الطباعة الجينومية ، والتعبير عن أليل محددة ، والعمليات الخاصة الأبوية.
في الفئران ، مطلوب كل من المعلومات الجينومية الأمومية والأبية لنمو الجنين الطبيعي11. لذلك ، لم يكن من الممكن الحصول على الجراء كاملة الأجل عندما تم حقن ال haESCs البارثينوجينية البرية (phaESCs) لتحل محل جينوم الحيوانات المنوية5،8. للتغلب على كتلة النمو، يجب تصحيح البصمة الجينومية لجينوم الأم من ال haESCs البارثينوجينية إلى تكوين أبوي. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق التلاعب بالمناطق المثيلية المتمايزة. حتى الآن ، تم دراسة عمليات الحذف المستهدفة من H19- DMR ، Gtl2 - Dlk1 IG- DMR ، وRasgrf1- DMR لقمع الجينات المعبر عنها الأمهات في phaESCs3،5،8،12. أثبتت هذه الدراسات أن حذف كل من H19-DMR و IG-DMR كافية لتحويل الأم إلى تكوين بصمة أبوية يمكن أن تحل محل كروموسومات الحيوانات المنوية. الحقن داخل السيتوبلازمي من الكتائب التي تحمل حذف DMR اثنين في البويضات أسفرت عن الجراء شبه المستنسخة مع تردد بين 5.1٪ و 15.5٪ من الأجنة المنقولة من 2 خلية.
ويستند هذا البروتوكول على تطبيق phaESCs مع حذف كل من H19-DMR و IG-DMR، والتي نقوم بعبارة phaESCs بالضربة القاضية المزدوجة (DKO-phaESCs). نحن نقدم تعليمات مفصلة لتعديل البصمة الجينومية في الكتائب لإنشاء خطوط DKO-phaESC ، لحقن DKO-phaESCs في البويضات كبديل لجينوم الحيوانات المنوية ، لثقافة الأجنة شبه المستنسخة إلى الكيسات الأريمية ، والحصول على الفئران شبه المستنسخة. هذا البروتوكول هو مرجع للباحثين الذين يحتاجون إلى تلاعب دقيق ومباشر في الجينوم الأبوي وتوليد الأجنة والفئران شبه المستنسخة.

<table><tbody><tr><td>1.5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>15 ml Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>BSA fraction</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Demecolcine solution</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DR4 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Freezing medium</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Hepes solution</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Irradiated MEF</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td><td>(Homemade)</td><td>-</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Lipofection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac transposase plasmid</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX330 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX458 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>5 mL Tube</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>5 mL Tube with cell strainer cap</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>30-gauge 1/2 inch needle</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>B6D2F1 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD animal health</td><td>49451</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 IU</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>10-cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>6 cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Center-well dish</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Digital rocker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M16 medium</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Strontium chloride</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Borosilicate glass cappilary</td><td>Science product</td><td>GB100T-8P</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>CellTram 4r Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Holding pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microinjection pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microlaoder tips</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micromanipulaor arms</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>Microinjection</td></tr></tbody></table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

في الكائنات الحية مع التكاثر الجنسي، والخلايا الجرثومية هي مصدر الخلايا totipotent التي تتطور إلى أفراد جدد. في الفئران ، وتخصيب البويضات من قبل spermatozoon يخلق zygote totipotent. في الآونة الأخيرة، ذكرت العديد من المنشورات أن الخلايا الجذعية الجنينية haploid (haESCs) يمكن أن تكون بديلا عن الجينوم الجامدي وتسهم في الأجنة، التي تتطور إلى فئران. هنا، نقدم بروتوكولا لتطبيق haESCs البارثينوجينية كبديل للحيوانات المنوية لبناء الأجنة عن طريق الحقن داخل السيتوبلازمي في البويضات. يتكون هذا البروتوكول من خطوات لإعداد haESCs كبديل للحيوانات المنوية ، وحقن كروموسومات haESC في البويضات ، وزراعة الأجنة شبه المستنسخة. يمكن للأجنة أن تنتج فئرانا شبه مستنسخة خصبة بعد نقل الأجنة. استخدام haESCs كبديل للحيوانات المنوية يسهل تحرير الجينوم في الجرثومة ، ودراسات التطور الجنيني ، والتحقيق في البصمة الجينومية.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm at JoVE.com

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

تهدف هذه المقالة إلى إظهار استخدام الخلايا الجذعية الجنينية الهيمونوجينية كبديل للحيوانات المنوية لبناء أجنة شبه مستنسخة.

تطبيق الماوس البارثينوجينيك Haploid الخلايا الجذعية الجنينية كبديل للحيوانات المنوية

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

application-mouse-parthenogenetic-haploid-embryonic-stem-cells-as

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.5K Views.  ETH Zurich. تهدف هذه المقالة إلى إظهار استخدام الخلايا الجذعية الجنينية الهيمونوجينية كبديل للحيوانات المنوية لبناء أجنة شبه مستنسخة.

Video: Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

استخدام الأجنة المذابة بالتجميد لإنتاج الفئران المعدلة وراثياً بكفاءة عالية

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Genetics

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the efficiency in developing gene-knockout mice by inducing small indel mutation would be sufficient enough, the efficiency of embryo genome editing for making large-size DNA knock-in (KI) is still low. Therefore, in contrast to the direct KI method in embryos, gene targeting using embryonic stem cells (ESCs) followed by embryo injection to develop chimera mice still has several advantages (e.g., high throughput targeting in vitro, multi-allele manipulation, and Cre and flox gene manipulation can be carried out in a short period). In addition, strains with difficult-to-handle embryos in vitro, such as BALB/c, can also be used for ESC targeting. This protocol describes the optimized method for large-size DNA (several kb) KI in ESCs by applying CRISPR/Cas9-mediated genome editing followed by chimera mice production to develop gene-manipulated mouse models.

Here we present a protocol for developing genetically modified mouse models using embryonic stem cells, especially for large DNA knock-in (KI). This protocol is tuned up using CRISPR/Cas9 genome editing, resulting in significantly improved KI efficiency compared with the conventional homologous recombination-mediated linearized DNA targeting method.

كريسبر / كاس 9 بوساطة استهداف الجينات عالية الكفاءة في الخلايا الجذعية الجنينية لتطوير نماذج الفئران التلاعب بالجينات

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the ...

<meta charset="utf8"></head><body>إجراء حقن المنوية المستديرة الفئران لدراسة التطور الجنيني

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>حقن الفأر المستدير Spermatid

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

حقن الفأر المستدير Spermatid

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

<meta charset="utf8"></head><body>نموذج الفأر ICSI-ET لدراسة التأثيرات طويلة المدى على استقلاب الجلوكوز

Monitoring Blood Glucose in Mouse Offspring After Intracytoplasmic Sperm Injection

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life roughly equivalent to 40 human years. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is a commonly used assisted reproductive technology in clinical practice. However, given its relatively recent emergence about 30 years ago, the long-term effects of this technique on human development remain unclear. In this study, we established the ICSI combined with embryo transfer (ET) method using a mouse model. The results demonstrated that normal mouse sperm, after undergoing in vitro culture and subsequent ICSI, exhibited a fertilization rate of 89.57% and a two-cell rate of 87.38%. Following ET, the birth rate of offspring was approximately 42.50%. Furthermore, as the mice aged, fluctuations in glucose metabolism levels were observed, which may be associated with the application of the ICSI technique. These findings signify that the mouse ICSI-ET technique provides a valuable platform for evaluating the impact of sperm abnormalities on embryo development and their long-term effects on offspring health, particularly concerning glucose metabolism. This study provides important insights for further research on the potential effects of the ICSI technique on human development, emphasizing the necessity for in-depth investigation into the long-term implications of this technology.

<meta charset="utf8"></head><body>أضواء الكاتب: استكشاف الآثار الصحية طويلة المدى لحقن المنوية داخل الهيولى على النسل

Here, we present a protocol to establish an intracytoplasmic sperm injection (ICSI)-embryo transfer (ET) mouse model, allowing us to observe age-related changes in glucose metabolism that may be attributed to ICSI, providing insights into its potential long-term impacts on human development.

مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم في نسل الفأر بعد حقن المنوية داخل الهيولى

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life ...

العزل والتنميط الجيني لجنين الفأر المتراكم لتسلسل الخلية الواحدة

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

تسليط الضوء على المؤلف: خط أنابيب لتحليل الأجنة الطافرة الخاصة بالنسب بدقة خلية واحدة

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأجنة الفئران الكاملة الطافرة: من الأرومة إلى نهاية المعدة

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

تطبيق الماوس البارثينوجينيك Haploid الخلايا الجذعية الجنينية كبديل للحيوانات المنوية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

استخدام الأجنة المذابة بالتجميد لإنتاج الفئران المعدلة وراثياً بكفاءة عالية

كريسبر / كاس 9 بوساطة استهداف الجينات عالية الكفاءة في الخلايا الجذعية الجنينية لتطوير نماذج الفئران التلاعب بالجينات

حقن الفأر المستدير Spermatid

حقن الفأر المستدير Spermatid

حقن الفأر المستدير Spermatid

مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم في نسل الفأر بعد حقن المنوية داخل الهيولى

مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم في نسل الفأر بعد حقن المنوية داخل الهيولى

مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم في نسل الفأر بعد حقن المنوية داخل الهيولى

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأجنة الفئران الكاملة الطافرة: من الأرومة إلى نهاية المعدة

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأجنة الفئران الكاملة الطافرة: من الأرومة إلى نهاية المعدة