Agradecemos al Dr. Giulio Di Minin la derivación de líneas phaESC y al Dr. Remo Freimann por el funcionamiento de la citometría de flujo. También reconocemos a la Sra. Michèle Schaffner y al Sr. Thomas M. Hennek por apoyo técnico con transferencia de embriones. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional suiza de Ciencias (subvención 31003A_152814/1).

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Los autores no tienen nada que revelar.

La clonación de mamíferos por transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) ha sido pionera en los años1990 19,20,21. Estos desarrollos siguieron a estudios de clonación realizados 30 años antes en anfibios22. El considerable retraso refleja la dificultad de la embriología y la impresión genómica en mamíferos. El desarrollo del SCNT mamífero es la base para la aplicación de haESC para sustituir espermatozoides, que se detalla en este protocolo.
La sincronización del ciclo de celda es un factor importante para el éxito de SCNT23. Este es también el caso de inyección de haESC en este protocolo. La introducción de un genoma de donante en un receptor requiere que las fases del ciclo celular se igualan para evitar roturas cromosómicas o aneuploidies que abroguen el desarrollo del embrión. La semi-clonación tiene la complejidad adicional de que dos genomas y un citoplasto necesitan ser compatibles. Un informe anterior ha demostrado que la inyección de haESC androgenéticas detenidas en fase M produjo mejores tasas de desarrollo de embriones semi-clonados que la inyección de haESC en fase G1 en ocitos7. Este informe sugiere la fase M como un punto de sincronización adecuado para la semiagulación. En consecuencia, se detuvo mitoticamente a los faásicos con demecolcina e inyectaron en el ooplasma de ocitos MII, que fueron detenidos naturalmente en metafase II de meiosis. Es importante destacar que la detención en fase M se puede lograr en los ESC del ratón con alta eficiencia, proporcionando una excelente sincronización entre los ciclos celulares de donantes y receptores.
Durante la mitosis, la membrana nuclear se descompone y se forma un husillo al que se adhieren los cromosomas replicados. Después de la inyección de DKO-phaESCs de fase M, los cromatátidos hermanos se segregan en un cuerpo pseudo polar y el cigoto7 (Figura 3E). En consecuencia, un solo conjunto de cromosomas de un DKO-phaESC contribuye al embrión semi-clonado. Es fundamental que los cromosomas hermanos de los cromosomas DKO-phaESC se puedan segregar correctamente después de la inyección. La membrana plasmática de un DKO-phaESC intacto evita la segregación en un cuerpo pseudo polar. De hecho, observamos casos raros en los que la membrana plasmática de los DKO-phaESCs no se rompió, y los embriones exhibieron DKO-phaESCs intactos en el ooplasma después de la inyección (Figura 3D). Por lo tanto, se debe tener cuidado de eliminar la membrana plasmática de los DKO-FASC mediante pipeteo. Durante la inyección, es igualmente importante evitar la interrupción del husillo meiotico del ócito, que podría conducir a defectos de segregación cromosómica e inducir la aneuploidía también.
En los mamíferos, la impresión genómica limita la aplicación de fases como reemplazo de espermatozoides. Los haESC partenogenéticos poseen una configuración materna de impresiones genómicas, mientras que los espermatozoides poseen una configuración paterna. Por lo tanto, la generación de cachorros a término no se ha producido después de la inyección de fasfas de wildtype como reemplazo de espermatozoides. Para superar esta limitación, las eliminaciones de los IG- y H19-DMR se diseñan en fases. La modificación de la expresión impresa en el Igf2-H19 materno y gtl2-Dlk1 loci es suficiente para cambiar la configuración de las impresiones genómicas para permitir la generación de ratones semi-clonados con una frecuencia de más del 5,1%, basado en embriones transferidos de 2 células. Estas observaciones sugieren que apuntar a dos genes impresos cambia el genoma de los fasc en una configuración paterna funcional que puede reemplazar a los espermatozoides en ratones. No obstante, para esta estrategia es necesaria una modificación genética permanente de las fases. Como estrategia alternativa, se puede considerar la haESC androgenética. Los haESC androgenéticos se derivan del genoma del esperma y poseen huellas paternas. Se ha informado de que el tipo salvaje y los haESC androgenéticos contribuyeron como reemplazo de espermatozoides para generar cachorros a término a una frecuencia entre el 1,3% y el 1,9% de los embriones transferidos4,7,24. Los cachorros a término también se han obtenido inyectando haESC androgenéticos con eliminaciones del IG- y H19- DMR a una frecuencia del 20,2% de los embriones de 2 células transferidos24. El aumento de la eficiencia de la semi-clonación utilizando haESC androgenéticos modificados es probable porque las impresiones pueden volverse inestables en el cultivo. Los defectos de impresión se corrigen mediante las deleciones genéticas de los DMR críticos.
Teniendo en cuenta la dificultad de introducir modificaciones genéticas directamente en los genomas de los ócitos o espermatozoides, los haESC son una herramienta valiosa para manipular los genomas parentales por separado. El uso de haESCs como sustituto de los espermatozoides proporciona una ventaja notable para la edición del genoma en la línea germino del ratón. Un estudio reciente ha combinado la edición del genoma basada en CRISPR/Cas9 con la aplicación de haESC para la caracterización de regiones de impresión que son críticas para el desarrollo embrionario12. Este estudio analizó el papel del Rasgrf1-DMR en combinación con el H19-y IG-DMR en el desarrollo de ratones bimaternal, y la función de 7 DMR diferentes en el desarrollo de ratones bipaternales. El método para sustituir los haESC por espermatozoides formó la base para enfoques genéticos de detección para identificar aminoácidos clave dentro de la proteína DND1 en el desarrollo primordial de células germinales y para identificar genes en el desarrollo óseo24,25,26. Los estudios sobre la impresión genómica y el cribado genético para identificar factores clave en el desarrollo embrionario son enfoques considerables para la aplicación de los haESC como genomas áticos.

En los mamíferos, los gametos son las únicas células que transmiten información genética a la próxima generación. La fusión de un ócito y un espermatozoide forma un cigoto diploide que se convierte en un animal adulto. Las mutaciones en genomas áticos son heredadas por la descendencia e impulsan la variación genética en la especie1. Se ha aplicado la introducción de mutaciones en la línea germinal para producir animales genéticamente modificados para diversos estudios biológicos, incluida la caracterización de la función génica y el modelado de enfermedades. Tanto los ocitos como los espermatozoides son células diferenciadas terminalmente y altamente especializadas que han dejado de proliferar. Por lo tanto, la modificación directa de gametos es técnicamente difícil, y se han desarrollado enfoques especializados. Las modificaciones genéticas pueden introducirse en la línea germinal del ratón mediante la inyección de ESC genéticamente modificados en blastocquistas, donde se integran en el embrión en desarrollo y colonizan la línea germinal. Además, la modificación genética de los cigotos utilizando enfoques de edición del genoma, incluido el sistema CRISPR/Cas9, se ha adoptado ampliamente2.
Recientemente, se ha notificado un enfoque excepcional, que aplica haESCs como sustituto de un genomagametic 3,4,5,6,7,8. Los haESC son líneas de células madre derivadas de la masa celular interna de blastocistos haploides partefenogenéticos o androgenéticos y poseen un solo conjunto de cromosomas4,7,9,10. Se ha demostrado que tanto los haESC partenogenéticos como los haESC androgenéticos pueden contribuir al genoma de ratones semi-clonados después de la inyección intracitoplasmática en ocitos. A diferencia de otros enfoques, los genomas de los haESC pueden modificarse directamente en el cultivo debido a su capacidad de autorretración. La introducción de modificaciones genéticas en la línea germinales mediante la sustitución de espermatozoides por haESC es un método importante para los estudios biológicos. Prevé la posibilidad de cultivo separado y manipular el genoma materno o paterno, que se derivan de haESCs partefenogenéticos o androgenéticos, respectivamente. A continuación, los HaESC se pueden utilizar como reemplazo del genoma ático, lo que es especialmente ventajoso para los estudios de la impresión genómica, la expresión específica del alelo y los procesos específicos de los padres.
En ratones, se requiere información genómica materna y paterna para el desarrollo normal del embrión11. Por lo tanto, los cachorros a término no pudieron obtenerse cuando se inyectaron haESC partenogenéticos de tipo salvaje (fasfascos) para reemplazar el genoma del esperma5,8. Para superar el bloque de desarrollo, es necesario corregir la impresión genómica del genoma materno de los haESC partefenogenéticos a una configuración paterna. Esto se puede lograr mediante la manipulación de las regiones metiladas diferencialmente (DMR). Hasta la fecha, se han estudiado eliminaciones específicas del H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR y Rasgrf1-DMR para reprimir los genes expresados maternamente en fases3,5,8,12. Estos estudios demostraron que las eliminaciones tanto del H19-DMR como del IG-DMR son suficientes para convertir a un materno en una configuración de impresión paterna que puede sustituir a los cromosomas de espermatozoides. La inyección intracitoplasmática de falanges que transportan las dos eliminaciones dmr en ocitos produjo cachorros semi-clonados con una frecuencia entre el 5,1% y el 15,5% de los embriones transferidos de 2 células.
Este protocolo se basa en la aplicación de fases con eliminaciones de H19-DMR e IG-DMR, a las que denominamos fases eliminatorias dobles (DKO-phaESCs). Proporcionamos instrucciones detalladas para la modificación de la impresión genómica en fases para establecer líneas DKO-phaESC, para la inyección de DKO-fasfas en ocitos como sustituto de un genoma de espermatozoides, para el cultivo de embriones semi-clonados a blastocistas y para la obtención de ratones semi-clonados. Este protocolo es una referencia para los investigadores que requieren una manipulación precisa y directa del genoma paterno y la generación de embriones y ratones semi-clonados.

<table><tbody><tr><td>1.5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>15 ml Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>BSA fraction</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Demecolcine solution</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DR4 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Freezing medium</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Hepes solution</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Irradiated MEF</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td><td>(Homemade)</td><td>-</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Lipofection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac transposase plasmid</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX330 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX458 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>5 mL Tube</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>5 mL Tube with cell strainer cap</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>30-gauge 1/2 inch needle</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>B6D2F1 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD animal health</td><td>49451</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 IU</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>10-cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>6 cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Center-well dish</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Digital rocker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M16 medium</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Strontium chloride</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Borosilicate glass cappilary</td><td>Science product</td><td>GB100T-8P</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>CellTram 4r Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Holding pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microinjection pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microlaoder tips</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micromanipulaor arms</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>Microinjection</td></tr></tbody></table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

En organismos con reproducción sexual, las células germinales son la fuente de células totipotentes que se convierten en nuevos individuos. En ratones, la fertilización de un ócito por un espermatozoide crea un cigoto totipotente. Recientemente, varias publicaciones han informado de que las células madre embrionarias haploides (haESC) pueden ser un sustituto de los genomas áticos y contribuir a los embriones, que se convierten en ratones. Aquí, presentamos un protocolo para aplicar haESC partenogenéticos como sustituto de los espermatozoides para construir embriones mediante inyección intracitoplasmática en ocitos. Este protocolo consiste en pasos para preparar los haESC como reemplazo de espermatozoides, para la inyección de cromosomas haESC en ocitos y para el cultivo de embriones semi-clonados. Los embriones pueden producir ratones semi-clonados fértiles después de la transferencia de embriones. El uso de haESCs como reemplazo de espermatozoides facilita la edición del genoma en la línea germinaria, los estudios de desarrollo embrionario y la investigación de la impresión genómica.

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Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Este artículo tiene como objetivo demostrar el uso de células madre embrionarias heploideas partefenogenéticas como sustituto de los espermatozoides para la construcción de embriones semi-clonados.

Aplicación de células madre embrionarias haploides partegenéticas del ratón como sustituto de los espermatozoides

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.5K vistas.  ETH Zurich. Este artículo tiene como objetivo demostrar el uso de células madre embrionarias heploideas partefenogenéticas como sustituto de los espermatozoides para la construcción de embriones semi-clonados.

Video: Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

Derivación de líneas de células madre de embriones de preimplantación de ratón

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

Uso de embriones congelados descongelados para la producción de alta eficiencia de ratones modificados genéticamente

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Genética

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the efficiency in developing gene-knockout mice by inducing small indel mutation would be sufficient enough, the efficiency of embryo genome editing for making large-size DNA knock-in (KI) is still low. Therefore, in contrast to the direct KI method in embryos, gene targeting using embryonic stem cells (ESCs) followed by embryo injection to develop chimera mice still has several advantages (e.g., high throughput targeting in vitro, multi-allele manipulation, and Cre and flox gene manipulation can be carried out in a short period). In addition, strains with difficult-to-handle embryos in vitro, such as BALB/c, can also be used for ESC targeting. This protocol describes the optimized method for large-size DNA (several kb) KI in ESCs by applying CRISPR/Cas9-mediated genome editing followed by chimera mice production to develop gene-manipulated mouse models.

Here we present a protocol for developing genetically modified mouse models using embryonic stem cells, especially for large DNA knock-in (KI). This protocol is tuned up using CRISPR/Cas9 genome editing, resulting in significantly improved KI efficiency compared with the conventional homologous recombination-mediated linearized DNA targeting method.

Focalización génica altamente eficiente mediada por CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias para desarrollar modelos de ratón manipulados genéticamente

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Procedimiento de inyección de espermatida redonda murina para estudiar el desarrollo embrionario

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Inyección de espermatida redonda de ratón

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Inyección de espermatida redonda de ratón

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Aislamiento y genotipado de embriones de ratón gastruladores para secuenciación unicelular

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Autor destacado: Un canal para analizar embriones mutantes específicos de linaje a una resolución de una sola célula

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

Secuenciación de ARN unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Germen de Trasplante de Células y Tejidos Testículos xenotrasplante en ratones

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

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Resumen

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Inyección de espermatida redonda de ratón

Inyección de espermatida redonda de ratón

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Secuenciación de ARN unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación

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Secuenciación de ARN unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación

Germen de Trasplante de Células y Tejidos Testículos xenotrasplante en ratones